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目的:肝纤维化(hepatic fibrosis)是慢性肝损伤的组织代偿性反应,若不及时去除潜在致病因素将会进一步发展为肝硬化甚至肝癌。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)等细胞因子刺激下,其增殖、活化表型发生改变是肝纤维化发生、发展过程中的中心事件。研究发现TNF-αA94T(rs1800620)和TNF-αP84L(rs4645843)单核苷酸基因多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs),会影响TNF-α蛋白氨基酸之间的氢键网络和相互作用力,减小TNF-α蛋白结构的稳定性,进而下调TNF-α水平。本实验旨在通过构建TNF-α野生型、TNF-αA94T/P84L突变型的HSCs稳转细胞株模型,研究TNF-αSNPs对人肝星状细胞系LX-2增殖、活化、凋亡和迁移等生物学功能的影响及潜在分子机制。方法:PCR扩增合成TNF-αc DNA,以此为模版点突变合成TNF-αA94T和TNF-αP84L。与线性化载体重组后,在DH5α感受态细菌中转化,挑选阳性克隆经测序验证后,进行慢病毒包装。转染至LX-2细胞系,嘌呤霉素筛选阳性细胞,获得稳转株。分别采用实时荧光定量PCR(Real time quantitative PCR,RTq-PCR)、Western blot和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组细胞TNF-αm RNA和蛋白水平。采用CCK-8法检测TNF-αSNPs对HSCs增殖的影响;采用RTq-PCR检测TNF-αSNPs对HSCs活化指标Ⅰ型胶原蛋白、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、基质金属蛋白酶(matrix-metalloproteinase,MMP)2和9的m RNA水平的影响;采用流式细胞术检测TNF-αSNPs对HSCs细胞凋亡的影响;采用Transwell法检测TNF-αSNPs对HSCs迁移能力的影响;采用ELISA检测TNF-αSNPs对HSCs炎症因子IL-6和TGF-β1表达水平的影响;采用Western blot检测TNF-αSNPs对NF-κB信号通路蛋白P-IκB-α、P-P65、IκB-α和P65表达的影响。结果:经测序验证、嘌呤霉素筛选及倒置显微镜观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)表达,TNF-α野生型、TNF-αA94T/TNF-αP84L突变型稳转细胞株构建成功。RTq-PCR、Western blot和ELISA实验发现,与野生型TNF-α转染组(WT组)相比,TNF-αA94T(A94T组)和TNF-αP84L(P84L组)能显著下调TNF-αm RNA和蛋白水平。CCK8检测细胞增殖能力发现,在72 h和96 h时,WT组较空质粒组(GFP组),细胞数量显著降低;而A94T和P84L突变组与WT组相比,细胞数量显著增多,表明TNF-αSNPs能显著减小TNF-α对HSCs的生长抑制作用。RTq-PCR检测HSCs活化指标m RNA水平,结果表明WT组与空质粒组相比,能显著下调Ⅰ型胶原蛋白和α-SMA的m RNA水平,能显著上调MMP-2/9的m RNA水平;而A94T和P84L突变组与WT组相比,能显著增加Ⅰ型胶原蛋白的水平,并能显著减少MMP9的m RNA水平;此外,TNF-αA94T能上调α-SMA的m RNA含量,并下调MMP2 m RNA水平。流式细胞术检测各组细胞凋亡水平,发现各组凋亡率无显著差异。Transwell法发现,WT组与空质粒组相比,穿透小室薄膜的细胞数量显著降低;而A94T和P84L突变组与WT组相比,能显著减小TNF-α对HSCs的迁移抑制作用。ELISA检测发现,WT组能上调IL-6的表达;而TNF-αA94T/P84L能显著下调IL-6的表达水平;此外,各组间TGF-β1的含量无显著差异。Western blot检测相关NF-κB通路蛋白发现,WT组较GFP组能上调P-IκB-α和P-P65的蛋白水平,并下调IκB-α的水平;而TNF-αA94T/P84L突变组较WT组,能显著下调P-IκB-α和P-P65的蛋白表达,并上调IκB-α的水平。结论:TNF-αA94T/P84L基因多态性位点能下调TNF-αm RNA和蛋白水平,能减小TNF-α对HSCs增殖、活化和迁移的抑制作用,可能与抑制NF-κB信号通路活化相关。