特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purura,ITP)是一种获得性器官特异性自身免疫性疾病。以往认为自身抗体致敏的血小板被单核巨噬细胞系统过度吞噬破坏是ITP的主要发病机制,这是体液免疫理论支持的病因理论,但是这一理论并不能完全解释ITP的发病机制。近几年,随着研究的不断深入,越来越多的证据表明,ITP除体液免疫功能紊乱外,还有细胞免疫的作用机制。以往的研究认为,Thl细胞功能失调能够引起严重的炎症反应并诱导多种自身免疫性疾病的发生。Thl细胞主要通过分泌干扰素γ (interferon, INF-γ)来介导细胞免疫,但是研究发现INF-γ缺陷鼠或INF-YR缺陷鼠虽然无INF-Y信号,仍可发生自身免疫性疾病,甚至对自身免疫性疾病更易感。这说明,除了Thl细胞外,还有另外的Th细胞亚群参与了自身免疫性疾病的发生。Th17是一种新型的效应性CD4+T细胞亚群,通过分泌IL-17等细胞因子发挥其功能特异性效应,越来越多的证据表明Th17细胞在多种自身免疫性疾病的发生发展中发挥着重要作用。肿节风为金粟兰科植物,具有活血化瘀、清热解毒、免疫调节等作用。研究发现,肿节风对巨噬细胞系统、T、B淋巴细胞均有一定的免疫抑制作用,对多种自身免疫性疾病有一定的疗效,如类风湿性关节炎、银屑病、血小板减少性紫癜和慢性非特异性溃疡性结肠炎等。但目前对肿节风在ITP治疗中的确切机制和作用靶点尚无进一步的研究。本课题研究分两个部分,第一部分通过检测ITP患者外周血Th17细胞数量和相关细胞因子表达,探讨ITP患者外周血Th17细胞的变化,以及在ITP发生中的作用。第二部分是建立和复制ITP小鼠模型,通过体内实验研究中药制剂肿节风对ITP小鼠Th17细胞数量和其分化调控相关细胞因子和转录因子表达的影响。目的通过对ITP患者外周血Th17细胞、功能相关细胞因子以及转录调控因子水平的检测,探讨Thl7细胞在ITP发病中的作用和意义；通过建立ITP小鼠模型,研究肿节风在ITP治疗中的作用,在体内对Thl7细胞、效应因子以及与诱导分化相关的重要转录因子的影响,阐明肿节风治疗ITP的机制和在治疗自身免疫性疾病中可能存在的作用靶点,为临床进一步应用肿节风提供实验基础。方法第一部分研究：选择慢性ITP患者30例,这些病例均符合慢性ITP的诊断标准,血小板数在5×109/L-78×109/L,之间,血小板中位数为30×109/L。无合并感染、病毒性肝炎、糖尿病、高血压、心血管疾病、妊娠和结缔组织病。正常对照组10名,均为健康人,血小板数在143×109/L-243×109/L之间,中位血小板数174×109/L。应用FCM检测ITP患者和正常对照组外周血中Thl7细胞的比例；ELISA技术检测ITP患者和正常对照组血浆中IL-17、IL-23、IL-21、IL-6和TGF-β1的表达水平；RT-PCR技术检测ITP患者和正常对照组外周血单个核细胞中IL-17和RORγtmRNA的表达水平；Western-blot法检测ITP患者和正常对照组外周血单个核细胞中pSTAT3和RORγt蛋白的表达水平。第二部分研究：取60只BALB／c小鼠随机分为正常对照组,ITP组,醋酸泼尼松阳性对照组、肿节风低、中、高剂量治疗组。采用免疫造模法腹腔注射豚鼠抗小鼠血小板抗体(GP-APS),建立ITP小鼠模型。观察肿节风对ITP模型小鼠外周血血小板、白细胞和红细胞的影响；并分别采用FCM、ELISA、RT-PCR及Western-blot等技术检测各肿节风对ITP模型小鼠Th17细胞比例、血清中相关细胞因子IL-17、IL-23、脾脏组织中IL-17、RORγtmRNA和pSTAT3和RORγt蛋白的表达水平的影响。结果第一部分：①ITP患者外周血Th17细胞比例(0.60+0.93%)较正常对照组(0.11±0.07%)显著升高(P<0.05)。②ITP患者血浆中IL-17、IL-23、IL-6和TGF-β1水平(分别为28.44±26.90pg/ml、0.35±0.18ng/ml、190.9±134.5pg/ml、1.19±0.81ng/ml))明显高于正常对照组(分别为7.61±9.38pg/ml、0.19±0.06ng/ml、86.3±22.6pg/ml、0.65±0.32ng/ml)(P<0.01)；血浆中IL-21水平(0.92±0.43ng/ml)与正常对照组(0.84±0.40ng/ml)相比无显著性差异(P>0.05)。③ITP患者PBMCs中IL-17和RORγtmRNA表达水平明显高于正常对照组(P<0.05)。④ITP患者PBMCs中pSTAT3和RORγt蛋白的表达水平(0.30±±0.07、1.044±0.31)明显高于正常对照组(0.17±±0.05、0.45±0.17)(P<0.05))。第二部分：①ITP模型组小鼠外周血血小板数与正常对照组相比明显降低(P<0.01)；肿节风治疗组与ITP模型组相比,血小板明显升高(P<0.01),以肿节风高剂量组效果最为明显。②ITP模型组小鼠与正常对照组比较脾脏细胞中Th17细胞明显升高(P<0.01)；肿节风中、高剂量组与ITP模型组相比,Th17细胞明显降低(P<0.05)。③ITP模型组小鼠与正常对照组比较血清中IL-17和IL-23水平明显升高(P<0.05,P<0.01)；与ITP模型组相比,肿节风中、高剂量组血清中IL-17明显降低(P<0.05),而各治疗组血清中IL-23水平与正常对照组比较无明显差异(P>0.05)。④ITP模型组小鼠与正常对照组比较,脾脏细胞中IL-17和RORγtmRNA表达增高(P<0.01)；与ITP模型组相比,肿节风中、高剂量治疗组脾脏细胞IL-17mRNA表达明显降低(P<0.01),肿节风低、中、高剂量组RORγtmRNA表达水平均明显降低(P<0.01)。⑤与正常对照组比较,ITP模型组小鼠脾脏细胞中pSTAT3和RORγt蛋白表达水平增高(P<0.01)：经肿节风中、高剂量治疗后,脾脏细胞中pSTAT3和RORγt蛋白表达水平明显减低,(P<0.01,P<0.05)。结论根据上述两部分的临床和动物实验的研究,本课题的结论是：①在ITP发生和发展中,Th17细胞亚群比例增高可能是一个重要的决定因素,Th17细胞相关的细胞因子及转录调控因子水平的变化与ITP发病密切相关。②成功制备了GP-APS,造模后小鼠的外周血血小板数下降,ITP小鼠模型建立成功。③肿节风能够使ITP小鼠一般状态好转,进食量、活动量增加,出血减少,外周血血小板数升高。说明肿节风可能通过阻断Th17细胞分化相关细胞因子和转录调控因子的表达水平,抑制ITP小鼠Th17细胞分化增殖,下调IL-17水平,达到治疗ITP的作用。④调节ITP患者中Th17细胞的异常可能成为ITP治疗的新策略。