目的:附子是毛茛科植物乌头子根的加工品,是中医临床常用药物,以其为主要成分的参附注射液在临床主要用于治疗心血管疾病。乌头碱(Aconitine)是附子以及参附注射液中的重要有效成分,具有心血管保护作用。临床研究表明心功能不全时心肌能量代谢紊乱,ATP生成不足,导致心室重构,加重心肌损伤。因此,改善心脏能量代谢是治疗心血管疾病的新策略。已有研究表明,乌头碱通过调节缺血心肌的能量代谢和信号传导,对缺血心肌产生保护作用。然而,乌头碱通过改善能量代谢产生心肌保护作用的机制尚未阐明。本研究以附子中的重要单体成分乌头碱为研究对象,从能量代谢角度切入,对乌头碱产生心肌保护的药理作用及其可能的作用机制进行探究。方法:(1)采用不同剂量的Ang II和乌头碱处理H9c2细胞,CCK-8法检测细胞存活率确定给药浓度,进一步采用定量PCR及Western-blot技术检测细胞内相关分子的m RNA及蛋白表达;(2)采用免疫荧光技术检测乌头碱对F-actin、Sirt3表达的影响;(3)使用透射电子显微镜检测乌头碱对H9c2细胞线粒体超微结构的影响;(4)通过荧光素酶法检测乌头碱对m PTP、NAD+/NADH的影响。(5)通过流式细胞术检测乌头碱对线粒体膜电位的影响;(6)使用Seahorse技术检测乌头碱对线粒体氧化磷酸化水平的影响;(7)采用免疫共沉淀技术检测乌头碱对Cyp-D乙酰化程度及Cyp-D与ANT-1相互作用的影响;(8)采用干扰小RNA技术敲低H9c2细胞内Sirt3的表达后,采用Seahorse技术检测乌头碱对线粒体氧化磷酸水平的影响,采用免疫共沉淀技术检测乌头碱对Cyp-D乙酰化程度,及Cyp-D与ANT-1相互结合的影响;(9)采用TAC方法建立心力衰竭大鼠模型,连续口服给药两周,末次给药后分离血清和心脏,其中血清用于检测检测大鼠生化指标,脏器用于病理分析、ATP含量的检测。结果:(1)细胞存活率检测结果显示,Ang II(1-100μmol?L-1)和乌头碱(0.1-100nmol?L-1)对H9c2细胞没有明显损伤。乌头碱通过减少心肌肥大细胞总蛋白和肌原纤维的合成产生抗心肌肥大作用。(2)透射电镜检测结果发现乌头碱能够保护心肌细胞线粒体的超微结构;流式细胞术检测结果表明乌头碱能够提高心肌肥大细胞的线粒体膜电位;(3)乌头碱通过促进Sirt3的表达,使Sirt3发挥去乙酰化作用,减少Cyp-D的乙酰化程度,减少乙酰化的Cyp-D与ANT-1结合,抑制m PTP的开放。(4)线粒体压力测试结果显示乌头碱能够剂量依赖性升高H9c2细胞的氧化磷酸化水平,促进线粒体呼吸链复合物I、III、V的表达;(5)敲低Sirt3表达的条件下,乌头碱抑制Cyp-D乙酰化的作用消失。(6)大鼠血清生化检测结果显示,乌头碱给药组的c Tn、CK、AST、LDH水平与TAC组相比明显降低,尤以高剂量组最为明显;大鼠心脏病理学检测结果表明乌头碱改善了心力衰竭大鼠心肌组织肿胀、变性、炎性浸润的现象;透射电镜检测结果表明乌头碱能够增加心力衰竭大鼠线粒体的数量,改善线粒体断裂、空泡化的现象。结论:本研究首次发现乌头碱能够通过调节线粒体功能改善能量代谢障碍,保护心肌组织,进一步证实其作用机制与Sirt3的激活密切相关。为验证乌头碱对心肌细胞的保护作用是否与改善线粒体的结构功能有关,采用分子生物学技术对与线粒体功能密切相关的多项指标进行考察。结果表明乌头碱呈剂量依赖性升高线粒体膜电位、保护线粒体超微结构、抑制m PTP的开放、激活Sirt3的活性、提高线粒体氧化磷酸化能力。为验证Sirt3的激活与乌头碱抑制m PTP开放的关系,采用si RNA敲低Sirt3时,发现当乌头碱抑制m PTP开放的作用消失,促进氧化磷酸化的作用消失。乌头碱改善线粒体功能,调节能量代谢的机制可能与激活Sirt3使其发挥去乙酰化作用,减轻Cyp-D的乙酰化程度,抑制m PTP的开放有关。研究结果表明Sirt3是乌头碱改善线粒体能量代谢的重要调控靶点,大鼠体内实验进一步验证了乌头碱对心肌组织和线粒体具有较好的保护作用。