D-对羟基苯甘氨酸（D-HPG）作为一些重要的β-内酰胺类抗生素的侧链基团,是半合成抗生素的医药中间体。海因酶法是目前最有潜力的D-HPG生产方法,其以D,L-对羟基苯海因为原料,经D-海因酶（DHase）和D-氨甲酰水解酶（DCase）两步催化反应生成D-HPG。DHase和DCase通常存在于野生型细菌或重组菌中,由于DCase活性低于DHase,限制了海因酶法的反应速率,并造成中间物积累。本文研究了重组枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）表达DCase,以及影响细胞DCase活性和稳定性的一些关键因素。采用人工基因PAE-adc表达DCase,构建了不同拷贝数整合表达和质粒表达的重组B.subtilis菌株。结果表明,基因拷贝数与细胞DCase活性不成比例关系,双拷贝整合表达菌株DN02的DCase活性最高,为132 U/g DCW。葡萄糖和蔗糖作为碳源,有利于提高细胞DCase活性。但是,PTS碳源所引起的碳分解代谢物阻遏效应导致发酵液酸化,而降低细胞DCase活性与稳定性。缺陷葡萄糖运输蛋白Pts G或抗终止蛋白Glc T,使葡萄糖吸收速率降低57%,能够显著缓解发酵液酸化,衍生菌DN12的DCase活性达到518 U/g DCW。Pts G缺陷与Glc T缺陷等效,表明pts G的表达强烈依赖Glc T的抗终止作用。Pts G能够补偿Glc U或Glc P的单缺陷或双缺陷,但Pts G,Glc P和Glc U共缺陷不再降低细胞的葡萄糖吸收速率,表明B.subtilis还存在未知的葡萄糖运输途径。在以葡萄糖为碳源的条件下,通过修饰cre box,而减弱Ccp A介导的葡萄糖对cit Z表达的抑制。结果使柠檬酸循环增大,乙酸合成量降低24%,发酵液酸化程度减轻,衍生菌株DN16p2的DCase活性达到615 U/g DCW。通过修饰调控元件而减弱Cod Y对cit B表达的抑制,结果使柠檬酸循环进一步增大及乙酸合成减少,衍生菌株DN17p3的DCase活性达到641 U/g DCW。由此过分增大柠檬酸循环通量,在供氧不变的条件下,将会诱导乳酸合成而加重发酵液酸化,对细胞DCase活性产生不利影响。通过Cit B的R741E点突变,消除Cit B对cit Z m RNA的去稳定作用,导致柠檬酸循环增大,乙酸产量降低71%,羟基丁酮产量降低16%。但是,进一步降低乙酸产量对提高细胞DCase活性仅有轻微作用。在B.subtilis中共表达DCase和DHase,细胞DCase活性低于对应的DCase单表达菌株,表明DCase的表达受到多拷贝质粒p UBS存在的抑制。