论文部分内容阅读
目的 研究A型激酶锚定蛋白12(AKAP12)对人乳腺癌细胞增殖和射线敏感性的影响及其相关机制的研究。方法 本课题实验研究首先利用乳腺癌生物信息学分析网站(http://bcgenex.centregauducheau.fr/BC-GEM/GEM-Accueil.php?js=1)分析不同分子分型乳腺癌的AKAP12表达水平;体外细胞培养,采用Western Blot实验检测不同分子分型乳腺癌细胞的AKAP12蛋白表达水平;采用慢病毒载体感染肿瘤细胞,在体外细胞水平干扰或外源性过表达AKAP12蛋白,采用Western Blot实验检测干扰或外源性过表达AKAP12后肿瘤细胞AKAP12蛋白表达水平上的变化,采用EdU细胞增殖检测法、CCK-8细胞增殖检测法以及细胞克隆形成实验检测干扰或外源性过表达AKAP12对乳腺癌细胞增殖能力的影响,继而采用Western Blot实验检测干扰或外源性过表达AKAP12后乳腺癌细胞与增殖有关的周期调控机制、凋亡机制的相关蛋白分子表达水平变化;体外细胞培养实验,采用直线加速器照射细胞,然后采用免疫荧光实验检测人乳腺癌细胞经射线照射后,在不同时间点DNA双链断裂(DSBs)标记蛋白γ-H2AX的多寡,干扰AKAP12表达肿瘤细胞以及干扰空载体细胞经射线照射后,采用Western Blot实验检测细胞周期调控相关蛋白、双链断裂标记蛋白在射线处理后随时间延后、损伤修复而产生的变化。结果 经乳腺癌生物信息学网站分析得知,不同分子分型乳腺癌细胞株AKAP12表达水平具有明显差异性,其中管腔型乳腺癌细胞株(如MCF-7)高表达AKAP12,三阴性乳腺癌细胞株(如MDA-MB-231)则明显低表达AKAP12,体外培养的不同分子分型乳腺癌细胞株AKAP12蛋白表达差异与生信分析结果相一致,乳腺癌细胞株AKAP12表达高低与乳腺癌细胞分子分型有关或起源细胞有关;Western Blot实验证明细胞成功转染;雌激素受体阳性(Estrogen receptor positive;ER+)人乳腺癌MCF-7细胞相对高表达AKAP12蛋白,干扰MCF-7细胞AKAP12蛋白表达可以加快细胞增殖速率,Western Blot实验证明干扰AKAP12表达通过下调抑癌基因p21、p27的表达,上调细胞周期依赖性激酶CyclinD1的表达,进而加快肿瘤细胞G1期至S期转换促进乳腺癌MCF-7细胞增殖;三阴性人乳腺癌(Triple negative breast cancer;TNBC)细胞 MDA-MB-23 1 低表达 AKAP12蛋白,外源性过表达AKAP12蛋白加快细胞MDA-MB-231增殖速率,Western Blot实验证明外源性过表达AKAP12蛋白通过上调肿瘤细胞bcl-2/bax蛋白比例以及下调抑癌基因p21、p27的表达,上调细胞周期依赖性激酶cyclinD1表达,外源性过表达AKAP12增加细胞凋亡抗性和加快肿瘤细胞G1期至S期转换,进而促进三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖能力。室温条件下,经9Gy射线照射处理细胞,干扰AKAP12表达的MCF-7细胞DNA双链断裂(DSB)修复完成所需时间相较于空载体组细胞延长,Western Blot实验证明干扰AKAP12表达通过破坏MCF-7细胞G1/S周期检验点,进而使得干扰AKAP12表达的MCF-7细胞逃逸G1/S周期检验点,未能及时完成受损DNA修复。结论AKAP12通过调控细胞G1期至细胞S期的转换影响不同分子分型乳腺癌细胞增殖,干扰AKAP12表达通过加快G1/S周期转换促进人乳腺癌MCF-7细胞(ER+,野生型P53)增殖,外源性过表达AKAP12通过增加凋亡抗性、加快G1/S周期转换促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞(ER-、PR-、HER-2,突变型P53)增殖;另外,干扰AKAP12表达使得射线照射乳腺癌MCF-7细胞逃逸G1/S周期检验点的检查从而增加其射线敏感性。图15表12参58