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吩嗪化合物是一种含氮杂环化合物,其合成基因簇由高度保守的7个基因簇phzABCDEFG构成,具有遗传上保守性和功能多样性。最新研究显示:吩嗪具有抗生素和信号分子双重功能,低浓度时作为信号分子参与基因表达调控,高浓度时作为抗生素抑制各种病原菌。假单胞菌M18从甜瓜植物根际分离,其代谢产物吩嗪-1-羧酸(PCA,商业名,申嗪霉素)是一种绿色高效,具有广谱的抗菌活性的生物制剂。本研究首先分析PCA合成的两个基因簇(phzA1-G1和phzA2-G2)的结构特点,阐明假单胞菌中吩嗪合成基因簇在进化中的保守性,其次证明其合成产物PCA作为信号分子参与诱导其自身合成的独特性:进而分别确定两个phz的转录起始位点,研究信号分子PCA参与调控的关键区域及调控水平,并在5-UTR区域寻找并确定参与两个基因簇表达关键的调控区域及机制。最后研究全局调控子GacA对两个基因吩嗪基因簇调控模式的区别。
通过全基因组测序,确定了假单胞菌M18中含有两个结构基因高度同源的phz基因簇phzA1-G1和phzA2-G2共同参与PCA合成,其两侧的修饰基因及启动子区域明显不同。其次通过基因敲除及外源PCA添加试验,确定了两个基因簇及其产物PCA形成一种特殊的循环放大调控系统,即由phzA2-G2基因簇产生少量PCA作为信号分子激活phzA1-G1表达积累大量PCA,并利用荧光定量PCR方法验证。进一步确定两个基因簇的转录起始位点,构建转录和翻译融合片段,测定β-半乳糖甘酶活性,表明phzA1-G1基因簇具有高效转录及被诱导活性,但转录后存在强的抑制区,而phzA2-G2基因簇具有低的转录活性,但转录后受某个调控因子激活作用。结合生物信息学mfold软件分析两个基因簇5-非翻译区(UTR)的二级结构,发现phzA1-G1的5-UTR区域存在两个关键抑制区(+1～+90bp)和(+220nt～+337nt),进一步分析(220nt～337nt)的次优结构,推测此区域可能潜在一个关键的核糖开关(Riboswitch),通过其结构变化在转录或翻译水平上调节phzA1-G1的表达。最后确定全局调控子GacA在转录后水平负调控转录活性低的pzA2-G2基因簇表达。因此,全局调控因子GacA及两个phz合成基因簇构成了一个受5-UTR反馈调控循环系统精细调控PCA合成,此特点赋予菌株M18在不同环境选择压力下,合成代谢产物的灵活性以满足环境及自身存活的需求。