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家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cypovirus,BmCPV)属于呼肠弧病毒(reovirus)。BmCPV能感染家蚕中肠细胞引起质型多角体病,导致蚕茧歉收。细胞自噬(autophagy)是真核生物通过分解代谢维持细胞稳态的一种生命现象,也是机体一种非常重要的保护和防御机制。目前为止,BmCPV感染与宿主防御机制的相互作用关系尚不明确。BmCPV感染与细胞自噬的研究对于理解病毒与宿主的相互作用机制有重要的意义。1.BmCPV感染可以诱导家蚕细胞发生自噬本研究通过透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察,研究了 BmCPV感染的家蚕中肠细胞的病理学变化,在感染细胞中观察到自噬体样的结构;LC3全称为微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated proteins light chain 3,MAP1LC3),可以标记自噬体的形成,被用做自噬的标记物。将指示自噬体形成的pIZ-EGFP-LC3质粒转染家蚕卵巢(B.mori ovarian,BmN)细胞,发现BmCPV感染能明显增加细胞内自噬体的数量;Western Blotting检测结果显示,在BmCPV感染的BmN细胞以及家蚕中肠中,LC3-Ⅱ蛋白相对水平明显升高。这些结果表明,BmCPV感染可以诱导家蚕细胞发生自噬。2.BmCPV感染引起线粒体自噬为了探究BmCPV感染引起的自噬类型,通过TEM观察比较BmCPV感染的家蚕中肠和正常家蚕中肠细胞,在感染细胞中可观察到受损的线粒体和线粒体自噬体结构;利用特异性抗体,通过Western Blotting检测BmCPV感染BmN细胞中PINK1-Parkin 介导的线粒体自噬(mitochondrial autophagy,mitophagy)信号通路上相关蛋白相对水平的变化。Western Blotting检测结果显示,在BmCPV感染的BmN细胞中,PINK1、Parkin和P-Drp1蛋白相对水平明显升高,Tom20蛋白相对水平明显下降;进一步通过siRNA沉默Parkin和Drp1基因,发现Parkin基因沉默后,Parkin/α-tubulin 比值显著下降,LC3-Ⅱ/α-tubulin 比值显著下降;Drp1基因沉默后,P-Drp1/α-tubulin 比值显著下降,LC3-Ⅱ/a-tubulin 比值下降。这些结果表明,BmCPV感染引起细胞线粒体自噬;阻断线粒体自噬通路抑制病毒感染引起的自噬。3.自噬助益BmCPV的增殖为了探究BmCPV感染与自噬的关系,选用经典自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,Rap)和经典自噬抑制剂 3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine,3-MA),分别处理BmN细胞,尔后感染BmCPV。当用Rap处理BmN细胞时,Western Blotting结果显示BmCPV结构蛋白VP4/α-tubulin的水平显着升高,qPCR结果显示BmCPV vp1基因的表达水平升高。而当BmN细胞用3-MA处理时,Western Blotting和qPCR出现相反的结果。这些结果表明BmCPV感染引起的细胞自噬对病毒的增殖有促进作用。4.BmCPV结构蛋白VP4是引起自噬的关键蛋白为了明确BmCPV感染引起自噬的关键病毒蛋白,选用LC3-EGFP-mCherry融合蛋白标记自噬体。用pIZT-CS1-pIZT-CS10 10个不同的病毒蛋白表达质粒转染pIZ-LC3-EGFP-mCherry BmN细胞。结果显示,病毒VP4蛋白可以显着增加自噬体的数量。此外,Western Blotting结果显示,在VP4过表达的BmN细胞中,PINK1,Parkin和P-Drp1蛋白的水平显着增加,而Tom20蛋白的水平则相反地降低,与BmCPV感染的BmN细胞的结果一致。这些结果表明,编码结构蛋白VP4的BmCPV是诱导线粒体吞噬的关键蛋白之一。