哺乳动物的卵巢是一个十分复杂的动态发育的器官,包含不同发育阶段的卵泡,如原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和有腔卵泡。但是,在卵巢的发育过程中,只有为数不多的卵泡能够发育成熟并排卵,绝大多数发生闭锁。在卵泡发育过程中,FSH和LH等促性腺激素发挥了重要作用。FSH和LH能够促进卵泡的发育和优势卵泡的选择,诱导优势卵泡的排卵和黄体的形成。随着研究的深入,除了促性腺激素外,自分泌和旁分泌因子,如生长因子和细胞因子,对于卵泡的发育也起到非常重要的作用。越来越多的研究结果表明内质网应激相关的分子伴侣对于卵泡的发育、闭锁以及黄体化过程起到至关重要的作用。但是目前对于内质网应激相关的分子伴侣调节卵泡发育的具体分子机制的研究还非常的少。HERP(Homocysteine-responsive ER-resident protein)是内质网膜蛋白,内质网应激能够诱导其高表达。HERP通过内质网相关的降解途径(ER-associated protein degradation,ERAD)参与内质网腔内的未折叠或者错误折叠蛋白的降解。HERP能够维持内质网中Ca2+的平衡和线粒体的功能。HERP在多种组织和器官中表达,例如心脏、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺。研究表明HERP可能参与糖尿病、神经退行性疾病和肌肉衰减症等疾病的发生和发展的过程。本研究通过免疫组化、RNA干扰、western blot、荧光定量PCR、ELISA、流式细胞术和免疫荧光等技术对小鼠卵巢中HERP的分布以及在颗粒细胞中的功能和作用进行了研究。主要的试验结果如下:⑴检测了HERP在仔鼠、未成熟小鼠和正常发情周期小鼠卵巢中的表达。HERP在卵母细胞和排卵前颗粒细胞中表达较高,在卵泡膜细胞和黄体细胞中表达较低;并且在促性腺激素处理和发情周期过程中其表达具有一定的规律性,在发情过程中其表达较高。⑵设计了3条针对小鼠Herp基因的RNAi序列,并成功构建了shRNA慢病毒干扰载体。经过病毒包装得到的干扰慢病毒通过倍比稀释的方法测定其病毒滴度达5-10×107IU/mL。为了鉴定其干扰效果,RAW 264.7细胞经Herp干扰慢病毒转导后,筛选出具有有效干扰效果的干扰片段,测定其干扰效率在80%左右。筛选出稳定抑制Herp基因表达的RAW 264.7细胞,在内质网应激诱导剂的作用下,抑制Herp基因表达能够显著下调内质网应激相关基因的表达,但是在炎症反应相关基因的表达上具有不同的调节作用。⑶体外培养小鼠卵巢颗粒细胞并且转导Herp干扰慢病毒后,测定其干扰效率在70%左右。对颗粒细胞分泌类固醇激素、细胞周期和凋亡进行检测,发现和正常颗粒细胞相比,抑制Herp表达能够通过增加芳香化酶基因Cyp19a1和抑制代谢相关基因Cyplbl的表达从而促进雌激素的分泌;还能够通过抑制细胞周期相关基因cyclin A1、cyclin B1和cyclin D2的表达阻滞细胞周期,在正常体外培养条件下,细胞凋亡率没有显著变化。⑷在赤霉烯酮诱导体外培养的颗粒细胞凋亡过程中,颗粒细胞的凋亡对于赤霉烯酮的处理具有剂量和时间的依赖性,随着浓度的增加和时间的延长颗粒细胞的凋亡率逐渐增加。而且,自噬晚期抑制剂CQ能够显著增加赤霉烯酮诱导的颗粒细胞的凋亡。在赤霉烯酮诱导体外培养的颗粒细胞凋亡过程中,赤霉烯酮能够促进自噬的标志性蛋白LC3-Ⅱ的表达,促进内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP和HERP的表达以及抑制MAPK和mTOR信号中pERK和pS6K的表达,内质网应激抑制剂4-PBA能够显著抑制赤霉烯酮诱导的内质网应激相关蛋白的表达以及CQ能够显著增加赤霉烯酮诱导的LC3-Ⅱ的表达,推测赤霉烯酮可能通过增强内质网应激信号和抑制MAPK和mTOR信号诱导细胞自噬的发生。⑸抑制HERP能够显著降低赤霉烯酮诱导体外培养的颗粒细胞的凋亡。在赤霉烯酮处理的颗粒细胞中,干扰HERP增加自噬的标志性蛋白LC3-Ⅱ和BCL-2,而降低活化Caspase-3和BAX的表达。表明抑制HERP表达能够通过增强细胞自噬和抑制凋亡信号,降低赤霉烯酮诱导体外培养颗粒细胞的凋亡。综上所述,本研究从体内和体外两个方面研究了HERP在卵泡颗粒细胞中的作用及其分子调控机制。为HERP功能研究提供了新的理论依据,充实了卵泡发育的研究内容。