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目的:通过观察体现“补肾生髓成肝”治疗法则的“地五养肝胶囊”对四氯化碳(CCL4)诱导的MSG-大鼠肝纤维化模型的影响及机制,研究“地五养肝胶囊”调控EMT/MET失衡的作用机制,揭示EMT/MET失衡所致的“髓失生肝”病因病机和“补肾生髓成肝”调控肝再生和EMT/MET失衡的科学内涵,为肝纤维化的临床治疗提供新的治疗思路和方向。方法:Wistar大鼠新生乳鼠,于出生第2、4、6、8、10天时皮下注射左旋谷氨酸单钠(MSG)-生理盐水溶液,剂量为每次4mg/g体重。28天离乳后,6周龄时分笼饲养,选取注射MSG-生理盐水溶液的雄性大鼠18只随机分为3组(每组6只):①MSG-大鼠空白对照组(以下简称对照组),②四氯化碳诱导MSG-大鼠肝纤维化“地五养肝胶囊”治疗组(以下简称治疗组),③四氯化碳诱导MSG-大鼠肝纤维化模型组(以下简称CCL4-MSG-模型组)。再随机选取6只Wistar正常雄性大鼠为模型对照组,即④四氯化碳诱导正常大鼠肝纤维化模型组(以下简称CCL4-模型组),故实验共分为4组。对照组大鼠给予大豆油皮下注射6周,2次/周,剂量为1m L/kg;治疗组、CCL4-MSG-模型组、CCL4-模型组大鼠给予50%CCl4/大豆油溶液皮下注射6周,2次/周,剂量为1m L/kg。在造模同时,治疗组大鼠给予地五养肝胶囊-生理盐水溶液灌胃6周,1次/日,剂量为360mg/kg;而对照组、CCL4-MSG-模型组、CCL4-模型组大鼠给予等体积的生理盐水灌胃6周。6周后处死全部大鼠,分别取4组大鼠脑组织下丘脑部分做苏木素-伊红(HE)染色,以观察MSG-大鼠造模情况。分别取4组大鼠肝组织进行特殊染色处理:肝组织苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色,以观察肝脏损伤程度和肝组织胶原纤维含量。用实时荧光定量RT-PCR反应和蛋白免疫印迹法(Western-blotting)观察MSG-大鼠肝组织E-钙粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin),转化生长因子-β1(TGF-β1)和骨形成蛋白7(BMP-7)以及与EMT/MET失衡相关的Hedgehog信号通路标志物信号激活配体SHH、信号传递跨膜受体PTC和SMO、核内转录因子Gli-1的m RNA和蛋白表达。实时荧光定量RT-PCR法所得Ct值,以GAPDH为内参,对照组为标准值“1”,用2-△△Ct计算法计算。Western-blotting法所拍的图像用Gel-pro analyzer软件进行处理,选定分析区域,获取平均积分光密度值(Integrated option density,I0D)。所有数据均利用统计软件SPSS17.0中文版处理,结果以Mean±SD表示。进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)来统计分析,p﹤0.05为差异具有统计学意义。根据统计结果绘制图表。结果:下丘脑组织病理切片(HE染色)结果显示,MSG-大鼠下丘脑弓状核神经元细胞发育明显异常,MSG-大鼠下丘脑神经元受损。肝组织病理切片(HE染色)结果显示:对照组肝脏组织结构基本正常;治疗组、CCL4-模型组和CCL4-MSG-模型组均出现肝细胞脂肪变性和气球样变,以及肝纤维化结缔组织增生;但是“地五养肝胶囊”治疗组比CCL4-MSG-模型组的MSG-大鼠肝细胞损伤减轻,肝纤维化程度降低;CCL4-MSG-模型组比CCL4-模型组肝细胞损伤更多、更明显,肝纤维化程度更重。肝组织胶原纤维含量测定(Masson染色)结果,即是肝纤维化程度结果显示:CCL4-MSG-模型组(16.23±9.76)与对照组(0.04±0.05)相比,肝纤维化组织增生显著增多;CCL4-MSG-模型组(16.23±9.76)与CCL4-模型组(10.10±1.92)相比,肝纤维化程度更重;治疗组(2.54±1.71)与CCL4-MSG-模型组(16.23±9.76)相比,肝纤维化组织增生明显减少;以上结果均具有统计学意义,p<0.05。实时荧光定量RT-PCR结果显示:①CCL4-MSG-模型组比对照组上皮细胞标志物E-cadherin(0.75±0.42)表达减少、间质细胞标志物Vimentin(7.33±5.11)表达增高,表明CCL4诱导的MSG大鼠在肝纤维化过程中发生了EMT。经“地五养肝胶囊”治疗后,治疗组与CCL4-MSG-模型组相比,治疗组(1.48±1.21)大鼠肝组织的E-cadherin的m RNA含量的表达明显高于CCL4-MSG-模型组(0.75±0.42),治疗组(0.95±0.64)大鼠肝组织Vimentin的m RNA含量的表达明显低于MSG-CCL4-模型组(7.33±5.11),以上结果经统计学处理,差异显著,p<0.05。②四氯化碳诱导MSG大鼠肝纤维化组织中发现CCL4-MSG-模型组TGF-β1 m RNA含量(6.01±5.92)高于对照组,而BMP-7 m RNA含量(0.63±0.24)低于对照组;“地五养肝胶囊”治疗组大鼠肝纤维化组织中发现TGF-β1(1.17±0.69)m RNA含量的表达水平比CCL4-MSG-模型组(6.01±5.92)下降,而BMP-7(1.24±0.76)m RNA含量比CCL4-MSG-模型组(0.63±0.24)的表达上升;TGF-β1/BMP-7的比值治疗组(1.04±0.76)较CCL4-MSG-模型组(9.75±4.78)明显下降,以上结果经统计学处理,差异显著,p<0.05。③对照组大鼠肝组织中Hedgehog信号通路处于静默状态,而CCL4-MSG-模型组大鼠肝组织中Hedgehog信号通路处于激活状态,故Hedgehog信号通路相关标志物m RNA的表达CCL4-MSG-模型组均高于对照组;而经“地五养肝胶囊”治疗后的治疗组Hedgehog信号通路处于受抑制状态,故激活配体SHH治疗组(1.46±0.92)较CCL4-MSG-模型组(4.12±3.28)、膜受体PTC治疗组(0.96±0.38)较CCL4-MSG-模型组(2.21±1.10)和膜上联合受体SMO治疗组(1.66±1.30)较CCL4-MSG-模型组(4.90±3.52)、核转录因子Gli1治疗组(3.35±2.75)较CCL4-MSG-模型组(8.46±9.72)的m RNA含量表达均显著减少,以上结果经统计学处理,差异明显,p<0.05。Western blotting结果显示:①CCL4-MSG-模型组与对照组相比,CCL4-MSG-模型组(0.79±0.34)的上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达明显低于对照组(4.51±2.27),CCL4-MSG-模型组(1.68±0.61)间皮细胞标志物Vimentin蛋白的表达高于对照组(0.20±0.13)。经“地五养肝胶囊”治疗后,治疗组与CCL4-MSG-模型组相比,治疗组(3.76±3.61)的E-cadherin蛋白的表达高于CCL4-MSG-模型组(0.79±0.34),而Vimentin蛋白的表达治疗组(0.99±0.29)低于CCL4-MSG-模型组(1.68±0.61),以上结果经统计学处理,差异显著,p﹤0.05。表明经“地五养肝胶囊”治疗后大鼠肝纤维化过程中的EMT受到一定程度的抑制,促进了MET的发生,从而减轻了肝纤维化的病情进展;②大鼠肝纤维化组织中TGF-β1蛋白的表达,CCL4-MSG-模型组(1.98±1.15)较对照组(0.13±0.07)明显升高,经治疗后治疗组(0.46±0.08)较CCL4-MSG-模型组(1.98±1.15)明显下降;但是BMP-7蛋白的表达则是CCL4-MSG-模型组(0.56±0.18)较对照组(2.15±0.53)明显降低,而治疗组(3.30±0.57)较CCL4-MSG-模型组(0.56±0.18)明显升高,故TGF-β1/BMP-7的比值治疗组(0.81±0.33)比CCL4-MSG-模型组(6.31±1.17)显著减少,以上结果经统计学处理,差异显著,p﹤0.05;③对照组中Hedgehog信号通路未激活其相关标志物的蛋白表达量都很低,而在CCL4-MSG-模型组中由于Hedgehog信号通路的激活相关标志物的蛋白表达量都显著升高,如通路激活所需配体SHH CCL4-MSG-模型组(2.68±1.15)较对照组(0.29±0.15),膜受体PTC CCL4-MSG-模型组(5.11±1.79)较对照组(0.27±0.10)和膜上联合受体SMO CCL4-MSG-模型组(3.66±1.67)较对照组(0.25±0.13),核转录因子Gli-1 CCL4-MSG-模型组(1.50±0.37)较对照组(0.29±0.06)均显著升高;经“地五养肝胶囊”治疗的治疗组MSG大鼠肝组织中Hedgehog信号通路明显受抑制其相关标志物的蛋白表达量都显著降低,如通路激活所需配体SHH治疗组(1.37±0.20)较CCL4-MSG-模型组(2.68±1.15),膜受体PTC治疗组(2.04±0.85)较CCL4-MSG-模型组(5.11±1.79)和膜上联合受体SMO治疗组(1.06±0.36)较CCL4-MSG-模型组(3.66±1.67),核转录因子Gli1治疗组(0.77±0.30)较CCL4-MSG-模型组(1.50±0.37)均显著减少,以上结果经统计学处理,差异显著,p<0.05。结论:四氯化碳诱导MSG大鼠肝纤维化模型组比四氯化碳诱导正常大鼠肝纤维化模型组的大鼠肝纤维化程度更重。CCL4诱导的MSG大鼠肝纤维化存在EMT/MET失衡的“髓失生肝”的病因病机,其肝组织上皮细胞标志物表达水平下调,而间质细胞标志物表达水平上调。“地五养肝胶囊”能延缓或减轻肝纤维化的发生发展,通过调节EMT/MET失衡(抑制EMT而促进MET)从而改善“髓失生肝”。并且在CCL4诱导的MSG大鼠肝纤维化中发现Hedgehog信号通路处于激活状态,TGF-β1的表达明显增高,而BMP-7的表达明显减少,实验结果表明“地五养肝胶囊”可能是通过抑制Hedgehog通路的活化和降低TGF-β1/BMP-7的比率来调节EMT/MET失衡,从而逆转肝纤维化的发展。