苜蓿是多年生牧草,因其草质质量好,产量和营养价值高,鸡羊等各类畜禽均喜食,因此可作为重要的饲料作物。GH11家族木聚糖酶是一类能够水解木聚糖主链β-1,4-D-木糖苷键的糖苷水解酶类,其温度适应范围较广,耐热性较好,在苜蓿饲料工业生产中具有重要的研究价值。目前,国内外对木聚糖酶的研究主要在产木聚糖酶菌种的筛选和驯化、木聚糖酶的分子结构和功能改造、木聚糖酶的理化性质等方面,而利用酵母双杂交技术进行木聚糖酶相互作用蛋白的筛选方面的研究几乎没有报道。本研究旨在通过酵母双杂交技术筛选出与木聚糖酶的互作蛋白,从而为研究木聚糖酶对木聚糖的降解机制,木聚糖酶合成机制以及耐热木聚糖酶的生产奠定了理论基础。研究结果如下:1.嗜热真菌F1208酵母双杂交cDNA文库的构建利用SMART方法构建酵母双杂交cDNA文库,并检测cDNA文库的容量为1.50×10~6,滴定度是4.20×10~7 cfu/ml,且片段大小在200-2000 bp之间,说明该cDNA文库合格,可用于后续实验。2.酵母双杂交筛选木聚糖酶互作蛋白根据目的基因序列设计克隆引物扩增T-Xyn基因,并构建重组载体pGBKT7-T-Xyn,并检测其无自激活和毒性。通过酵母双杂交筛选互作蛋白,共培养菌液涂布于酵母缺陷型培养基DDO/X/A(SD/-Leu/-TrpX-α-Gal/AbA)固体平板中,初次筛选到440个阳性单克隆,经过两次划线培养后,初步确认为阳性单克隆191个。3.木聚糖酶与候选蛋白的互作验证通过酵母双杂交实验再次验证,共筛选出40个与嗜热真菌F1208木聚糖酶有相互作用的蛋白。进一步使用Pull-down实验验证木聚糖酶T-Xyn与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、双烯内酯水解酶(DLH)和谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白之间的相互作用。本研究筛选并鉴定木聚糖酶互作蛋白,对探究研究木聚糖酶对木聚糖的降解机制,木聚糖酶合成的分子机制以及耐热木聚糖酶的生产提供了科学依据。