论文部分内容阅读
目的:慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是一种破坏性的疾病,近年来逐渐被视为主要公共卫生问题,其病程进展缓慢,但最终导致不可逆的肾单元丢失、终末期肾病。CKD发生发展过程中肾间质炎症的发生与肾小管上皮细胞的变化密切相关。坏死性凋亡是除凋亡外重要的程序性细胞死亡类型,2005年Degterev等人首次提出,并将其命名为“necroptosis”。它是一种非caspase依赖性细胞死亡模式,可由肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的受体相互作用蛋白(receptor integrated protein,RIP)来调控。坏死性凋亡在多种疾病的炎症反应过程中起重要作用,但坏死性凋亡与人肾小管上皮细胞炎症因子表达的关系目前尚不清楚。我们前期研究发现坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)可以减轻单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)小鼠的肾脏炎症反应,但具体的调控机制还未明确。在前期实验的基础上,本实验以人肾小管上皮细胞HK2为研究对象,以TNF-α、泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK为刺激物,构建坏死性凋亡的细胞模型,进一步给予细胞Nec-1干预,转染RIP1过表达质粒,深入探讨人肾小管上皮细胞发生坏死性凋亡及相关炎症的机制,从而为阐明肾小管损伤在CKD进展中的作用提供新思路。方法:体外培养人肾小管上皮细胞HK2,应用TNF-α联合Z-VAD-FMK(T/Z)刺激24 h。乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性实验检测细胞死亡百分比,Western blot检测观察坏死性凋亡相关指标RIP1以及IKK-α、NF-kB p65、p-NF-kB p65的表达,Western blot和ELISA测定白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)的水平,RT-PCR检测NF-kB p65的m RNA表达水平。进一步分别及联合应用Nec-1、PDTC进行干预,RIP1过表达质粒转染,检测上述指标。免疫共沉淀法检测RIP1泛素化相关指标泛素(Ubiquitin,Ub)蛋白的表达。结果:1.TNF-α/Z-VAD-FMK诱导了HK2细胞RIP1表达Western blot结果显示,与对照组相比,TNF-α单独刺激HK2细胞RIP1(P<0.05)、cleaved-caspase3(P<0.01)的蛋白水平均增加,联合应用Z-VAD-FMK刺激RIP1的蛋白水平进一步显著增加(P<0.01),cleaved-caspase3(P<0.01)的蛋白水平降低。LDH细胞毒性试验结果显示,与对照组相比,T/Z刺激HK2细胞后细胞坏死百分比增高(P<0.01),在此刺激条件下给予Nec-1干预,HK2细胞死亡百分比下降(P<0.01),转染RIP1过表达质粒细胞死亡百分比显著增高(P<0.01)。2.坏死性凋亡诱导了HK2细胞炎症因子的表达Western blot及ELISA结果显示,与对照组相比,T/Z刺激HK2细胞后IL-1β(P<0.05)、MCP-1(P<0.01)蛋白水平增高,在此刺激条件下给予HK2细胞Nec-1干预蛋白水平降低(P<0.05或P<0.01);反之,转染RIP1过表达质粒蛋白水平明显上调(P<0.05或P<0.01)。3.坏死性凋亡激活了HK2细胞NF-kB通路Western blot结果显示,与对照组相比,T/Z刺激HK2细胞后IKK-α、NF-kB p65、p-NF-kB p65的蛋白水平增高(P<0.01)。在此刺激条件下给予Nec-1干预后降低了其蛋白水平(P<0.05或P<0.01);而转染RIP1过表达质粒后明显上调了其蛋白水平(P<0.01)。RT-PCR结果与Western blot结果趋势相同。4.抑制NF-kB通路减轻了坏死性凋亡诱导的HK2细胞炎症因子表达Western blot结果显示,与对照组相比,T/Z刺激HK2细胞后IL-1β、MCP-1的蛋白水平增高(P<0.01),在此刺激条件下单独给予HK2细胞PDTC干预,上述蛋白水平显著降低(P<0.01),联合应用Nec-1干预后蛋白水平降低更显著(P<0.01)。5.TNF-α/Z-VAD-FMK诱导HK2细胞RIP1泛素化免疫共沉淀结果显示,与对照组相比,T/Z刺激HK2细胞后RIP1蛋白泛素化水平升高。结论:1.RIP1介导的坏死性凋亡参与了人肾小管上皮细胞的炎症因子的表达,这可能是部分通过调节NF-kB信号通路活化实现的。2.TNF-α/Z-VAD-FMK可能诱导了RIP1泛素化,初步提示其可能参与了人肾小管上皮细胞炎症因子的表达。