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第一部分EPHB4在妊娠相关组织和细胞中的表达及定位目的检测EPHB4蛋白在人早孕绒毛、蜕膜组织以及晚孕胎盘中的表达及定位,同时比较EPHB4基因在人原代EVT和多种滋养细胞系中的表达差异。方法1.实验分组:子痫前期组和正常对照组:收集两组孕妇晚孕期胎盘组织;采用IHC、q RT-PCR以及Western blot检测两组胎盘组织中的EPHB4的表达;2.采用IHC法了解EPHB4在早孕绒毛及蜕膜组织的定位表达;3.q RT-PCR检测比较人原代EVT、绒毛膜癌滋养细胞系JEG-3和JAR、以及人绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo中EPHB4的m RNA表达情况。结果1.子痫前期胎盘组织中EPHB4的表达明显高于对照组。2.EPHB4广泛表达于早孕绒毛中,在绒毛滋养细胞层呈强阳性表达;而在蜕膜组织中,EPHB4仅在血管内皮细胞中有少许表达,EVT细胞几乎不表达EPHB4。3.EPHB4基因人原代EVT中的表达显著低于JEG-3和JAR,而与HTR-8/SVneo细胞相比无显著差异。结论在绒毛滋养细胞向EVT分化的过程中EPHB4表达下调,以及EPHB4在子痫前期与正常胎盘组织中的表达差异,提示EPHB4可能通过调控EVT参与子宫螺旋动脉重铸,影响胎盘的形成及其功能。第二部分EPHB4调节EVT生物学行为在子宫螺旋动脉重铸中的作用目的 研究EPHB4对人绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞生物学行为的调控作用,并采用PDC系统验证其对子宫螺旋动脉重铸过程的影响。方法1.上调EPHB4的表达:EPHB4过表达组(转染EPHB4过表达质粒至HTR-8/SVneo),同时设立阴性对照组(转染相应的空载)、空白对照组(未进行细胞转染);2.q RT-PCR和Western blot检测转染效率;3.CCK-8法测细胞活性;4.AnnexinⅤ/PI双标流式细胞学技术以及Caspase-3比色法分析转染后细胞凋亡水平;5.Transwell模型检测细胞迁移及侵袭能力;6.PDC共培养系统验证上调EPHB4表达对子宫螺旋动脉重铸的影响;7.q RT-PCR以及Western blot法检测其可能的下游信号通路。结果1.转染后HTR-8/SVneo后过表达组EPHB4 m RN A和蛋白表达水平明显提高;2.EPHB4过表达的HTR-8/SVneo细胞显示更低的细胞活性和更弱的迁移和侵袭能力及血管内皮取代功能,而凋亡水平增加;3.PDC结果表明,EPHB4过表达组和阴性对照组相比,子宫螺旋动脉重铸处于更早期阶段,蜕膜组织中显示EVT数目较少且侵润程度较表浅,螺旋动脉结构破坏不够彻底;4.EPHB4过表达组细胞内PI3K和AKT的m RNA和蛋白表达水平均显著下降。结论EPHB4显著减弱HTR-8/SVneo的增殖、迁移、侵袭和血管内皮取代能力,增加细胞凋亡水平,PDC结果与体外实验趋势一致。研究提示,EPHB4可能通过负向调控EVT细胞的生物学行为,影响螺旋动脉重铸。第三部分HOXA9转录调控EPHB4介导滋养细胞迁移与侵袭功能目的探讨HOXA9调控EPHB4介导的绒毛外滋养细胞生物学功能的作用及其分子机制。方法1.实验分组:子痫前期组和正常对照组:收集两组孕妇晚孕期胎盘组织;采用IHC、q RT-PCR以及Western blot检测两组胎盘组织中的HOXA9和EPHB4的表达;分析两者表达水平相关性;2.采用IHC法对早孕绒毛组织进行HOXA9和EPHB4表达定位;3.细胞实验分组:sh-HOXA9:转染HOXA9沉默质粒至HTR-8/SVneo,对应的阴性对照组为scramble sh RNA(sh-Scb);HOXA9:转染HOXA9过表达质粒至HTR-8/SVneo,对应的阴性对照组为mock;sh-Scb+EPHB4:将HOXA9沉默阴性对照质粒与EPHB4过表达质粒共转染至HTR-8/SVneo;mock+sh-EPHB4:将HOXA9过表达阴性对照质粒与EPHB4沉默质粒共转染至HTR-8/SVneo;sh-HOXA9+EPHB4:将HOXA9沉默质粒与EPHB4过表达质粒共转染至HTR-8/SVneo;HOXA9+sh-EPHB4:将HOXA9过表达质粒与EPHB4沉默质粒共转染至HTR-8/SVneo;4.q RT-PCR和Western blot检测转染后细胞HOXA9对EPHB4的调节作用;5.Transwell实验模型检测细胞迁移及侵袭能力;6.构建EPHB4启动子荧光素酶报告基因载体,采用共转染和双荧光素酶方法分析HOXA9对EPHB4靶基因启动子区域转录活性的影响;染色质免疫共沉淀法探索HOXA9对EPHB4基因启动子区域是否存在直接作用。结果1.子痫前期胎盘中HOXA9和EPHB4的表达显著高于正常胎盘组织,EPHB4主要表达在细胞膜上,而HOXA9主要表达在细胞核内,且两者蛋白表达水平之间呈正相关;2.早孕绒毛组织IHC显示HOXA9几乎在所有细胞核内均有表达,而EPHB4主要表达在细胞滋养层细胞细胞膜;3.沉默HOXA9的表达,会抑制HTR-8/SVneo细胞中HOXA9和EPHB4蛋白表达水平和m RNA水平;HOXA9过表达质粒转染HTR-8/SVneo后,细胞HOXA9和EPHB4蛋白表达水平和m RNA水平增加;4.沉默HTR-8/SVneo细胞中HOXA9的表达,EPHB4表达下降,细胞转移和侵袭能力增强;若同时共转染EPHB4过表达质粒,EPHB4表达水平与对照组相比,几乎不受影响,且HTR-8/SVneo细胞转移和侵袭能力恢复至对照组水平;5.提高HTR-8/SVneo细胞中HOXA9的表达,EPHB4表达增加,细胞转移和侵袭能力减弱;若同时共转染EPHB4沉默质粒,EPHB4表达水平与对照组相比,几乎不受影响,且HTR-8/SVneo细胞转移和侵袭能力恢复至对照组水平;6.双荧光素酶和染色质免疫共沉淀检测结果显示HOXA9对EPHB4靶基因启动子有转录激活效应,正向调控EPHB4的表达。结论HOXA9转录激活EPHB4的表达,抑制滋养细胞的迁移和侵袭能力,可能是子宫螺旋动脉障碍的重要调控机制。第四部分IFN-γ介导EPHB4调控血管内皮细胞活化对滋养细胞侵袭的抵抗作用目的IFN-γ活化的内皮细胞抵抗滋养细胞侵袭,影响螺旋动脉重铸。该部分拟探讨EPHB4在该过程中的调控作用及具体机制。方法1.实验分组:子痫前期组和正常对照组:ELISA检测两组孕妇孕16-18周血清IFN-γ水平,采用q RT-PCR以及Western Blot检测两组收集两组孕妇晚孕期胎盘组织中的EPHB4和ICAM-1的表达;2.不同浓度IFN-γ及不同时间分别处理原代HUVECs,检测EPHB4和ICAM-1的表达变化;3.基因沉默和过表达修饰、CHIP和双荧光素酶法从分子学水平探讨IFN-γ对EPHB4和ICAM-1的表达调控;4.既往研究已证实IFN-γ活化的内皮细胞抵抗滋养细胞的侵袭取代,采用内皮细胞与滋养细胞共培养模型从细胞功能学角度验证EPHB4参与调控该过程。结果1.子痫前期组血清IFN-γ水平及胎盘组织中EPHB4和ICAM-1表达显著高于正常组;2.IFN-γ刺激下HUVECs中EPHB4和ICAM-1蛋白表达均增加,且呈浓度和时间依赖性;3.IFN-γ/STAT1信号通路通过EPHB4促进HUVECs活化,且参与调控HUVECs对滋养细胞侵袭和取代的抵抗作用;4.STAT1活化后形成二聚体入核,作用于EPHB4启动子区,上调EPHB4的转录表达。结论IFN-γ/STAT1信号通路可上调EPHB4的表达,促进内皮细胞的活化,进而抵抗滋养细胞侵袭,可能是螺旋动脉重铸异常的又一重要机制。