目的:白念珠菌是引起人类真菌感染的主要致病菌,在医院获得性感染中居第四位,死亡率接近50%,它常寄生在人类的口腔、下呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道中,可引起口腔泌尿生殖道等的表浅感染,也可通过血行播散和器官入侵引起免疫力低下病人致命的系统性感染,患者出现念珠菌血症、心内膜炎,中枢神经系统感染、眼内炎和骨髓炎,造成多器官功能的损害甚至死亡。在系统性白念珠菌感染过程中,强烈的炎症反应不仅对机体没有有利作用,反而对机体器官组织造成损伤。IL-23参与机体防御白念珠菌感染的天然免疫过程,IL-23产生后可刺激巨噬细胞产生更多的促炎因子,并可作用于Th17细胞,激活获得性免疫反应,进一步增强机体清除白念珠菌的能力,IL-23对Th17细胞的生存、增殖、再激活及产生IL-17是不可缺少的。因此,IL-23是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。Hsp90是一个进化保守、含量十分丰富的分子伴侣,不仅参与应激反应,还参与了炎症反应和天然免疫反应过程,它影响着大量客户蛋白的活性和信号通路的传导。本实验通过巨噬细胞与白念珠菌体外相互作用,探讨巨噬细胞与白念珠菌体外相互作用后IL-23的表达分泌水平及Hsp90抑制剂对IL-23表达分泌水平的影响。方法:1实验用小鼠昆明种健康小鼠30只,雌性,清洁级,4-5周龄,15~20g,由河北医科大学实验动物中心提供,合格证编号:1404078。2实验用菌株白念珠菌标准株ATCC 90028购于中国医学科学院微生物研究所。3菌株的活化和菌悬液的配制白念珠菌标准株复温后在沙氏培养基上活化三次,加入含0.1%吐温80的1640培养液,吸管吹打混匀,用血球计数板计数,调整终浓度至1-2×106/m L。4巨噬细胞分离培养及鉴定小鼠腹腔巨噬细胞分离法提取巨噬细胞,显微镜下计数,并用含10%胎牛血清的1640培养液进行培养,巨噬细胞培养3天后取出。巨噬细胞的鉴定采用形态学及免疫组化SP法:取出的巨噬细胞PBS洗涤3遍,丙酮固定,常规HE染色、瑞士-吉姆萨染色及免疫组织化学SP法检测巨噬细胞CD68抗原的表达,中性树胶封固。5实验分组与处理实验分为实验组和对照组。巨噬细胞培养3天后取出,离心洗涤后计数板计数。用含10%胎牛血清1640培养液调整终浓度至5-6×105/m L,转种至6孔板中,每孔2 ml,培养24小时后每孔加入浓度为1×106/m L菌悬液0.5 ml。实验组每孔分别加入0.01mmol/L~0.5mmol/L浓度的17-DMAG100mL,对照组加入同体积含10%胎牛血清1640培养液。0.1mmol/L浓度实验组及对照组分别于实验的第2、4、6、12小时收集细胞及上清液。不同浓度17-DMAG实验组于第4小时收集上清液。上清液-80℃冻存待测。各孔分别设3个平行孔。6流式细胞术检测IL-23的表达水平实验各组巨噬细胞从六孔板吹打下来后离心,PBS洗涤2遍,加入0.1%Triton X-100打孔,避光孵育20分钟,IL-23抗体染色,避光孵育15分钟,流式细胞仪检测巨噬细胞内IL-23的表达水平,用FACSDiva Software软件分析数据。7 ELISA法检测IL-23的分泌水平实验各组收集的上清液复温,按试剂盒说明操作,检测细胞培养液中IL-23在蛋白水平的表达。结果:1巨噬细胞培养形态观察培养第一天倒置显微镜下可见巨噬细胞为圆形和椭圆形,贴壁生长。培养第三天,显微镜下可见巨噬细胞体积略增大,为圆形,椭圆形,多角形,多数有伪足和凸起,贴壁生长。2巨噬细胞HE染色和瑞士-吉姆萨染色结果HE染色显微镜下可见巨噬细胞胞浆丰富,呈粉红色,核大深蓝色,瑞士染色显微镜下可见胞质淡蓝色,细胞核紫红色。两种染色均可见细胞核呈肾形,马蹄形,偏居于一侧。3巨噬细胞免疫组织化学结果CD68阳性反应定位于培养巨噬细胞的胞膜及胞浆。4流式细胞术检测巨噬细胞内IL-23表达水平结果在实验的2h、4h、6h及12h,实验组IL-23表达水平分别为6.24±1.16,8.09±1.15,10.54±0.67及3.69±0.21。对照组IL-23表达水平分别为8.19±1.01,10.06±0.32,12.10±1.97及4.76±0.86。实验组和对照组IL-23的表达水平均随着作用时间的延长先上升后下降,并在第6小时表达水平达高峰期。实验组表达水平明显低于对照组,F=55.643 P=0.000P<0.05,差异有统计学意义。5上清液中IL-23分泌水平检测结果。在实验的2h、4h、6h及12h,实验组IL-23表达水平(pg/m L)分别为225.17±7.95,243.60±5.81,257.61±12.48及259.19±7.92。对照组268.99±14.34,278.62±14.54,295.96±5.65及309.79±4.34。实验组和对照组IL-23的分泌水平均随着作用时间的延长不断升高,第6小时后增长速度明显减慢。实验组分泌水平明显低于对照组,F=17.41P=0.000 P<0.05,差异有统计学意义。6不同浓度HSP90抑制剂17-DMAG对上清液中IL-23分泌水平的影响。0.01mmol/L,0.1mmol/L,0.25mmol/L及0.5mmol/L浓度17-DMAG实验组上清液IL-23分泌水平(pg/m L)分别为261.21±2.02,254.09±1.92,248.69±1.30,234.41±3.81,随抑制剂浓度升高,IL-23分泌水平相应降低。F=64.43 P=0.000 P<0.05,差异有统计学意义。结论:1白念珠菌与小鼠腹腔巨噬细胞体外相互作用,随着作用时间的延长,IL-23表达水平先上升后下降。2白念珠菌与小鼠腹腔巨噬细胞体外相互作用,加入HSP90抑制剂后,IL-23表达及分泌水平明显下降。3 HSP90抑制剂对白念珠菌刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-23的表达及分泌水平的影响呈浓度及时间依赖性。综上结果表明,白念珠菌与小鼠腹腔巨噬细胞体外相互作用,加入HSP90抑制剂后,IL-23表达水平明显下降,并呈时间及浓度依赖性。HSP90抑制剂可能通过降低IL-23的分泌和表达,减少其对组织的损伤,从而对机体起保护作用。