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帕金森病(ParkinsonsDisease,PD)是临床上最常见的神经系统退行性疾病之一。其确切的病因与发病机制至今不明。其典型的病理改变是中脑多巴胺能神经元进行性变性缺失,纹状体多巴胺(dopamine,DA)含量降低。而纹状体DA递质的严重不足正是产生PD运动症状的直接原因。因此长期以来,临床上通过补充DA前体左旋多巴(levodopamine,L-DOPA)进行DA替代治疗。结果表明,该药短期应用十分有效,能很好地控制PD运动症状,但并不能阻止疾病的进展。而且,用药3～5年后,常出现严重的并发症,包括L-DOPA诱导的运动综合征(L-DOPAinduceddyskinesia)、开-关现象(on-off)和剂末现象(wearing-off)。出现上述并发症的确切机制尚不清楚,但是它让众多临床医生与研究者们认识到,简单地补充DA并不能从根本上治疗PD,而如何维持中脑DA神经元内的DA稳态才是治疗的根本。近年来,关于如何维持DA代谢稳态已经形成一个新的研究热点。已知中脑转录因子Nurr1所调控的下游靶基因包括参与DA合成的酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase,TH)和左旋多巴脱羧酶(L-DOPAdecarboxylase,DDC),负责DA重摄取的DA转运体(Dopaminetransporter,DAT)及负责DA储存的囊泡单胺转运体2(Vesicularmonoaminetransporter2,VMAT-2)。其与DA稳态调节关系十分密切。
已有的研究表明,PD相关基因DJ-1、PINK1与α-synuclein均与DA稳态维持有一定的联系。那么DJ-1、PINK1、α-synuclein与Nurr1这四个在DA稳态维持中十分重要的分子,它们之间有怎样的功能联系?它们之间的功能联系对于DA稳态维持又有怎样的意义?为解答上述问题,本课题拟从上述三个基因对转录因子Nurr1功能的调节作用与调节机制入手,探讨正常情况下DA稳态是如何调节与维持的。进而为我们理解PD疾病时DA稳态失衡的可能原因与机制提供有价值的线索。
首先,分别建立过表达野生型DJ-1(DJ-1/WT)及其L166P突变体(DJ-1/L166P)和DJ-1基因敲减(DJ-1/KD)的MN9D细胞模型与SpragueDawley大鼠模型。利用免疫荧光化学检测法、双荧光素酶检测法、Westernblot和RealtimequantitativeRT-PCR等方法,检测上述各组细胞中Nurr1功能的变化情况。结果发现,过表达DJ-1/WT可引起Nurr1核转位,其转录激活活性增强(p=0.00,n=8),其调节的下游靶蛋白TH(p=0.045,n=3)、DDC(p=0.045,n=3)和VMAT-2(p=0.032,n=3)均出现明显上调;而DJ-1/L166P组,无论Nurr1活性(p=0.691,n=8),还是Nurr1靶基因TH(p=0.523,n=3)、DDC(p=0.997,n=3)与VMAT-2(p=0.793,n=3),与对照组相比均无明显差异(p＞0.05)。而在敲减DJ-1基因后,Nurr1活性(p=0.037,n=3)及其下游靶基因TH(p=0.004,n=3)、DDC(p=0.027,n=3)和VMAT-2(p=0.028,n=3)明显下调。在动物整体水平上(慢病毒介导的基因过表达大鼠模型),研究发现过表达DJ-1/WT基因组与GFP对照组和假手术组相比,其Nurr1进核明显增多(p=0.014与GFP组相比,p=0.002与假手术组相比,n=3),其下游靶基因TH、DDC和VMAT-2明显上调(p＜0.05)。而过表达DJ-1/L166P基因组与GFP组及假手术组相比,其Nurr1进核无明显差异(p=0.291与GFP组相比,p=0.054与假手术组相比,n=3),其下游靶基因表达无明显差异(p＞0.05)。进一步研究发现,在MN9D或大鼠脑内过表达DJ-1/WT后,磷酸化(ERK1/2的激活形式)水平均明显增高(p＜0.05,n=3)。而在MN9D细胞内敲减DJ-1基因后,磷酸化ERK1/2及其上游激酶MEK1/2水平均出现下调(p＜0.01,n=3)。U0126抑制试验显示,随着ERK1/2信号通路被抑制,由DJ-1所介导的Nurr1核转位及其下游靶基因表达上调均出现一定程度的逆转。对磷酸化ERK1/2、胞核内Nurr1及细胞内TH水平进行相关性分析,显示两两之间存在显著的相关性。(p＜0.01,n=15)上述研究结果表明DJ-1可以通过ERK1/2信号通路调节Nurr1活性而调控TH、DDC和VMAT-2的表达,最终调控DA的合成、重摄取与储存。参与其中的信号分子ERK1/2将可作为临床开发PD治疗新药的作用靶点。
其次,我们构建了用于荧光共振能量转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET)的真核表达质粒载体pAmCyanl-N1-α-syn(CFP-α-syn)与pZsYellowl-N1-Nurr1(YFP-Nurr1)。将上述质粒在LipofectamineTM2000介导下,转染进入MN9D细胞。24h后,在激光共聚焦显微镜下观察是否发生FRET现象,并计算FRET效率。另一方面,通过RNA干扰(RNAi)的方法,建立PINK1基因敲减的细胞模型。在基因敲减24或48h后分别通过双荧光素酶报告系统检测Nurr1的转录激活活性。结果显示,所构建的CFP-α-syn与YFP-Nurr1两个载体可以较高效率地转染进入同一个细胞,且其所表达的CFP与YFP荧光强度较强,并未因形成融合蛋白而影响其荧光的亮度。对其进行FRET检测时显示,当用405nm激发光(CFP的激发光)激发时,不仅能在CFP通道观察到青色荧光,而且可以检测到YFP的荧光,说明发生了激光共振能量转移的现象。对其FRET效率进行计算,大约为20.52%。与阴性对照组、及实验对照组相比,有明显差异。(p＜021,n=23)这提示α-syn与Nurr1之间可能存在直接的相互作用。通过RNAi的方法抑制PINK1基因的表达,其干扰效率可达70%。对于PINK1基因敲减的细胞进行研究发现,在PINK1被抑制表达24或48h后,用双荧光素酶报告系统进行检测发现,报告基因萤火虫荧光素酶活性出现一定程度的下降。提示PINK1对Nurr1的活性具有一定的调节作用。
文献报道称α-syn可抑制Nurr1下游靶基因酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase,TH)的表达,而我们的研究提示α-syn与Nurr1可能存在相互作用。因此,α-syn很可能作为一个转录抑制因子,通过与Nurr1相互作用而抑制其活性,导致其下游靶基因表达减少,并最终使多巴胺(Dopamine,DA)合成减少。与之相反,PINK1对Nurr1可能存在一个正性调节作用。因此,α-syn与PINK1对Nurr1的调节可能存在一个相互协调的关系。
总之,本课题的研究结果表明,DJ-1与PINK1对Nurr1的功能呈正性调节作用,而α-syn可能作为一个转录抑制因子通过与Narr1相互作用对其呈负性调节作用。以前研究发现,DJ-1与PINK1及α-syn之间存在一定的相互作用,因此上述三个PD致病基因的协调作用对于Nurr1的正常功能及DA稳态的维持具有十分重要的意义。