过继细胞免疫治疗特异性杀伤膀胱癌细胞的实验研究

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背景:目前恶性肿瘤的治疗手段主要有手术、化疗、放疗,但由于恶性肿瘤的进展迅速,易复发,患者本身状况不能耐受等因素而限制了这些常规治疗方式的应用。面对低治愈率,高死亡率的恶性肿瘤,迫切需要新型的治疗方式来对当前的肿瘤治疗方式进行补充。近年来过继免疫细胞疗法(adoptive cellular immunotherapy,ACI)成为免疫治疗抗肿瘤研究的热点。当前研究主要集中在使用树突状细胞制备肿瘤疫苗、细胞毒性T淋巴细胞、以及通过T细胞受体或嵌合抗原受体对T细胞进行基因改良,使T细胞能够靶向并杀伤肿瘤细胞。DC细胞具有抗原提呈和共刺激能力,能够主动诱导体内产生特异性抗肿瘤免疫并且具有“免疫记忆”功能。因此基于DC细胞制备的DC疫苗或CTL具有强大的抗肿瘤能力。CAR T仅通过其表面表达的单链抗体特异性识别肿瘤细胞的表面抗原,而无须经过肿瘤细胞表面表达的主要组织相容性复合体提呈抗原信息,从而具有非MHC限制性。在特异性识别抗原后,CAR可以将抗原信号由胞外传递至胞内的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)从而启动T细胞的细胞毒作用来特异性杀伤肿瘤细胞。为了增强经过基因修饰的T细胞的增殖及活化能力,研究者在胞内引入了共刺激因子。根据共刺激因子的数量将CAR分为第一、二、三代。目前已有数百项针对不同肿瘤的CAR T疗法进入临床试验,靶向CD19的Kymriah和Yescarta已获批上市用于血液系统恶性肿瘤的治疗。前列腺干细胞抗原(PSCA)是在前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌等恶性肿瘤中高表达的一种肿瘤相关抗原,已有大量以PSCA为靶点的针对前列腺癌、胰腺癌的CAR T临床前及临床实验研究正在进行,部分已获得良好疗效。由此可见PSCA抗原在靶向实体瘤的肿瘤免疫治疗中可能成为理想的靶标,但其应用于膀胱癌的治疗当中尚未见报道。本实验通过第三代嵌合抗原受体PSCAscFv-CD28-CD137-CD3ζ制备的CAR T,不同于目前大多数研究者使用慢病毒,腺病毒等病毒载体对T细胞进行转染的方法,我们通过电穿孔将含有PSCA-CAR的mcDNA载体质粒成功转入了T细胞,使其表达PSCA-CAR,从而使T细胞实现MHC非限制性特异性识别并杀伤PSCA表达阳性的靶细胞的功能。该方法具有操作简单,节省时间,成本低廉,临床安全性高的优点。本研究在简化传统的细胞培养步骤、缩短培养周期的同时,实现了高效能DC疫苗及CTL的制备,并与PSCA靶向CAR-T的杀伤效率进行了对比和验证研究,为今后针对实体肿瘤膀胱癌的治疗型DC疫苗、CTL、以及PSCA-CAR T等细胞免疫治疗,提供了具有参考价值的理论依据和实验数据。第一部分PSCA-CAR T和膀胱癌特异性CTL的制备及体外抗肿瘤实验研究目的:制备靶向PSCA的第三代PSCAscFv-CD28-CD137-CD3ζCAR T和膀胱癌特异性CTL细胞制剂,并探究其在体外抗肿瘤能力。方法:密度梯度离心获取健康人外周血单个核细胞,分离培养获取DC及T细胞,使用肿瘤细胞裂解物负载DC制备DC疫苗及肿瘤特异性CTL细胞制剂;通过电穿孔将含有PSCA-CAR的mcDNA转导入T细胞,制备PSCA-CAR T细胞制剂;使用荧光显微镜观察转染后GFP+细胞表达情况,流式细胞术测定CAR在T淋巴细胞表面的表达效率、PSCA在膀胱癌细胞株RT4及前列腺癌细胞株PC-3M表面的表达情况;CCK-8比色法测定CTL、CAR T对RT4和PC-3M肿瘤细胞的杀伤效率;ELISA法检测CTL、CAR T与肿瘤细胞共培养上清中IL-2和IFN-γ的浓度。结果:1.成功制备膀胱癌细胞株RT4特异性DC疫苗及细胞毒性T淋巴细胞;2.电穿孔导入微环DNA转染T细胞,成功制备PSCAscFv-CD28-CD137-CD3ζCAR T,流式细胞仪分析显示表达率为47.9%。3.膀胱癌特异性CTL和PSCA-CAR T均对PSCA阳性表达的RT4细胞具有明显的杀伤作用且PSCA-CAR T杀伤效果优于CTL和普通T细胞。对于PSCA阴性表达的PC-3M细胞,PSCA-CAR T、CTL、普通T细胞的杀伤效率无明显统计学差异。4.膀胱癌特异性CTL和PSCA-CAR T均可在PSCA阳性表达的RT4细胞刺激下分泌大量的IL-2和IFN-γ且PSCA-CAR T分泌量大于CTL和普通T细胞。对于PSCA阴性表达的PC-3M细胞,PSCA-CAR T、普通T细胞的细胞因子分泌量无明显统计学差异。小结:使用微环DNA成功制备的CAR T和使用负载肿瘤裂解物的DC细胞致敏的CTL在体外能够特异性杀伤PSCA阳性表达的肿瘤细胞。第二部分PSCA-CAR T和膀胱癌特异性CTL在荷瘤小鼠体内抗肿瘤实验研究目的:研究PSCA CAR T和CTL在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤作用。方法:利用PSCA+膀胱癌细胞株RT4构建NOD-SCID小鼠膀胱癌肿瘤模型;成瘤后将小鼠随机分为3组,观察CTL、CAR T在小鼠体内的抑瘤作用;处死小鼠后使用免疫组织化学染色法处理肿瘤组织,检测其中的PSCA抗原的表达和人CD3~+T淋巴细胞浸润情况。结果:1.成功使用膀胱癌肿瘤细胞株RT4构建NOD/SCID荷瘤鼠模型;2.CTL和CAR T均能够在小鼠体内抑制肿瘤组织的生长且CAR T治疗组的肿瘤体积明显小于CTL治疗组和对照组;3.免疫组织化学染色结果显示肿瘤组织内高表达PSCA抗原,CAR T治疗组和CTL治疗组均可见CD3高表达。小结:使用微环DNA成功制备的CAR T和使用负载肿瘤裂解物的DC细胞致敏的CTL在荷瘤小鼠体内表现出强大的抗肿瘤能力。结论:1.通过电穿孔可以将含有编码CAR的基因序列的微环DNA载体转导到T细胞内并实现高效率的CAR表达。2.利用膀胱癌肿瘤细胞裂解物能够制备出膀胱癌特异性CTL。3.PSCA-CAR T和CTL在体外能够呈现出抗原依赖性激活和特异性杀伤,共培养上清中检测到明显升高的IL-2和IFN-γ;4.CTL和CAR T均能定向归巢到PSCA阳性的肿瘤组织内,发挥抑制肿瘤生长的作用。
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