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手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)近些年来在中国大范围流行,导致大量婴幼儿患者死亡。肠道病毒71型(enterovirus71, EV71)被认定为手足口病重症和致死病例中最主要的病原体。EV71是小RNA病毒家族的成员之一,和其他小RNA病毒相似,EV71的基因组为一条长约7.4kb的单股正链RNA,其中只有一个开放阅读框(open reading frame, ORF),在其ORF两端分别有5’和3’非编码区(untranslated regions,UTR)。在5’UTR区形成了高度保守的二级结构：三叶草状(clover leaf like)茎环结构(stem loop I)和一个内部核糖体进入位点(Internal ribosome site,IRES)，根据现有的对其他小RNA病毒的研究结果提示,5’UTR区的这两个结构与病毒的复制和翻译有着密切的关系。一些宿主蛋白可以与病毒5’UTR的三叶草茎环结构结合,调控病毒的RNA复制过程；而IRES结构可以在一些宿主蛋白以及IRES反式作用因子(IRES trans-acting factors,ITAFs)的共同作用下,以5’帽非依赖的方式起始病毒蛋白的翻译过程。同时,病毒基因组的3’UTR区被认为与病毒基因组的稳定和复制相关。EV71是嗜神经性肠道病毒,它可以感染宿主神经系统,引起无菌性脑脊髓膜炎、脊髓灰质炎样麻痹、脑干脑炎等并发症,重症病例具有较高的死亡率。EV71病毒感染神经细胞的分子机制是本实验室的研究重点。神经细胞中哪些宿主蛋白参与了病毒复制和翻译的调控过程——这是本文要解决的主要科学问题。在本文中我们首先构建及改造EV71全长cDNA感染性克隆。我们利用高保真RT-PCR技术成功将EV71全长cDNA基因组装入pBR322载体,构建了EV71全长cDNA克隆。将该克隆体外转录,转染对EV71敏感的RD细胞株,通过观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),用RT-PCR检测EV71负链基因组以及空斑法鉴定,验证了该克隆具备感染性。随后用空斑法建立了该感染性克隆拯救病毒的一步生长曲线(one-step growth curve)。随后我们运用定点突变技术在EV715’UTR中的IRES结构两端分别引入了两个单一的限制性内切酶识别位点(NsiI, XbaI),并验证了该突变株感染性克隆的感染性,为后续的替换或改造EV71IRES结构以研究病毒的神经嗜性实验奠定了基础。与此同时,我们筛选了与5’UTR、3’UTR相互作用从而影响EV71翻译或复制过程的宿主因子,特别是在EV71引起严重病变的中枢神经系统中影响该过程的宿主因子。我们将EV715’UTR及其分段的茎环结构、3’UTR制备为生物素标记的RNA探针,利用Biotin-pull down技术联合质谱分析,筛选出了两个可以和EV715’UTR特异结合的宿主蛋白PCBP2和PTBP1.随后我们使用双荧光素酶报告基因实验及Western blot验证了PCBP2在翻译水平上对EV71IRES介导的翻译过程的调控,用Realtime RT-PCR技术初步验证了PCBP2对EV71RNA复制过程的调控作用。