视网膜变性疾病是造成永久性视力丧失的主要原因之一,主要类型包括老年黄斑变性(age-related macular degeneration AMD)和视网膜色素变性(retinitis pigmentosa RP)。RP是一类由光感受器的丢失引起的,以视网膜色素沉积为特点的一类遗传性疾病。相反的,AMD则是以黄斑下脉络膜疣或脉络膜新生血管形成为主要特点的,主要影响老年人的一类疾病。目前针对AMD或者RP的治疗,主要是减缓细胞的凋亡以及视力的丧失,缺少有效的治愈性的措施。叶黄素以及抗氧化剂的使用,能够减缓AMD和RP的进展,抗VEGF注射以及激光疗法在减缓AMD的新生血管生成方面也有一定的效果,但都不能有效的阻止或逆转这些疾病的进展。因此基因治疗以及细胞替代治疗作为有良好的前景的治疗手段被广泛的研究。大量的研究表明,RPE移植或干细胞移植在RP的治疗中有较好的应用前景。Muller细胞为视网膜中重要的支持细胞,在神经元之间信息传递,内环境稳态的维持等中发挥重要作用。在低等动物,如斑马鱼中,视网膜发育过程中,视网膜周边的祖细胞能够分化产生处理视杆细胞外的所有神经元,而视杆细胞则是Muller细胞分化而来。当视网膜受损时,Muller细胞能够重编程为视网膜前体细胞并分化产生相应的神经元以修复受损的视网膜。然而在哺乳动物中,Muller细胞的这一特性却受到了限制,当视网膜受损时,激活的Muller细胞经过短暂的去分化过程后,迅速的发生胶质化。如何抑制Muller细胞的胶质化,促进其在程序化为视网膜前体细胞,也成为了当前研究的热点。Lin28是一种RNA结合蛋白,能够通过抑制Let-7 microRNA的表达,调节干细胞的多能性。在神经发育的过程中,Lin28与Let-7microRNA的相互调节,能促进干细胞的神经胶质发生。而在低等动物如斑马鱼中,Lin28对于Muller细胞的在程序化十分重要。我们实验室之前的研究也表明,Lin28b能够在RCS-P+大鼠中,诱导Muller细胞去分化为视网膜前体细胞。本研究构建以腺病毒为载体的Lin28b基因过表达体系,转染培养的LE大鼠Mu ller细胞,探讨Lin28b对Muller细胞的重编程作用以及相关机制,并在视网膜色素变性大鼠(RCS大鼠)模型中研究来自于Muller细胞重编程的视网膜前体细胞对变性视网膜的保护作用及作用机制。主要研究结果如下:一、Lin28b诱导LE大鼠Muller细胞的重编程。1.Lin28b诱导Muller细胞形态发生改变。Ad/Lin28b感染原代分离的LE大鼠Mu ller细胞后,Muller细胞能够稳定表达Lin28b,并在加入干细胞诱导培养基三天后,Muller细胞的胞体会逐渐的变圆,突起逐渐缩短,提示过表达Lin28b后,Muller细胞形态上趋近于视网膜前体细胞。2.Lin28b抑制Muller细胞GFAP表达。Ad/Lin28b感染原代分离的LE大鼠Muller细胞并在干细胞培养基条件下培养五天后,发现Muller细胞胶质相关基因GFAP的表达开始出现下降,随着培养时间的延长,GFAP的表达下降更加明显。提示,Lin28b能够抑制Muller细胞的胶质化。3.Lin28b诱导Muller细胞重新进入细胞周期并增殖。当Lin28b过表达后,在Mu ller细胞中增殖细胞相关核抗原Ki67阳性细胞比例明显升高,处于S期以及G2/M期的Muller细胞比例明显上调,提示Lin28b能够促进Muller细胞重新进入细胞周期并增殖。4.Lin28b诱导Muller细胞获得视网膜前体细胞特性。过表达Lin28b基因后,Mu ller细胞能表达视网膜前体细胞的标记如Pax6, sox2, Nestin,CHX10,与此同时,发现Pax6的表达要早于Sox2而出现,Nestin与Pax6的表达均于培养后三天出现高峰并随着培养时间的延长而表达下降,Sox2的表达于培养后第五天出现高峰,而CHX10的表达随培养时间的延长呈逐渐升高的趋势,于培养后第七天表达最高。Lin28b上调后能抑制Let-7microRNA的表达和促进asclla的表达。上述结果提示,Lin28b可能通过上调asclla,抑制let-7microRNA,诱导Muller细胞重编程为视网膜前体细胞。二、Lin28b重编程的Muller细胞来源的视网膜前体细胞(LRMD-RPC)移植挽救RCS大鼠视功能研究。l.LRMD-RPC (Lin28b reprogrammed Muller glia derived - retinal progenitor cells)能在RCS大鼠视网膜下腔存活、迁徙并保持其视网膜前体细胞的特性。LRMD-RPC移植进入RCS视网膜下腔后,能够存活,但存活的细胞随着移植时间的延长而逐渐减少。于移植后6周,仅能观察到少量的细胞。此外,在LRMD-RPC移植后2周时,能够保持视网膜前体细胞的特性,表达Pax6, Nestin,Sox2等。在LRMD-RPC移植后2周到4w,发现其主要在视网膜下腔发生横向迁徙,在移植后6周,可见少量的细胞能发生纵向迁徙,进入视网膜。2.LRMD-RPC RCS能保护RCS大鼠视网膜外核层并改善其视功能。当LRMD-RPC移植进入RCS视网膜下腔后,其能够在早期明显的发挥视网膜外核层保护作用。ERG检测表明,当LRMD-RPC移植后,b波幅值有所恢复。更进一步,我们发现,LRMD-RPC能够在移植后明显抑制Muller细胞的胶质化,并分化产生pkcα阳性的双极细胞。我们的数据表明,LRMD-RPC对于RCS-p+大鼠的视网膜具有明显的保护作用,并能够改善其视网膜的功能。综上所述,我们得到以下结论:一、Lin28b能够体外诱导LE大鼠Muller细胞发生重编程。二、Lin28b通过上调asclla同时下调microRNA let-7诱导Muller细胞发生重编程。三、LRMD-RPC RCS-P+视网膜下腔移植能保护视网膜外核层并改善视功能。四、LRMD-RPC抑制Muller细胞胶质化并分化产生双极细胞。