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目的:探讨细胞自噬对于B急性淋巴细胞白血病(B acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)细胞生长的影响,并探讨其作用机制。方法:(1)收集B-ALL病人骨髓样本及正常骨髓样本,通过流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)分析检测B-ALL病人骨髓细胞中CD34+38-、CD117+、CD45+、CD19+以及CD10+细胞比例与正常骨髓细胞的异同,流式细胞分选CD34+38-以及CD19+细胞,荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-RT-PCR)检测自噬相关基因的表达水平。(2)通过尾静脉注射B-ALL 697细胞,建立NOD-SCID小鼠急淋白血病模型,分为对照组,模型组,预防组和治疗组。预先或注射697细胞后腹腔注射雷帕霉素(Rapamycin,Rap)激活小鼠体内自噬水平,观察不同处理组小鼠的生存曲线,检测不同处理组小鼠的发病程度,包括血常规,肝脾病理变化,骨髓表达外源性白血病抗原标志,包括CD45、CD19和CD10。(3)流式细胞分析检测不同处理组NOD-SCID小鼠骨髓细胞周期以及LSK造血干祖细胞的比例变化。(4)在B-ALL体外细胞系697和小鼠模型中,通过Rap处理或饥饿处理激活自噬,通过Western blot检测融合蛋白E2A/Pbx1的表达量,激光共聚焦显微镜检测融合蛋白E2A/Pbx1与LC3的共定位。(5)在B-ALL体外细胞系697中,通过3-MA抑制自噬水平,MG-132抑制泛素化蛋白酶体,通过流式分析、Western Blot分别检测融合蛋白E2A/Pbx1及泛素化蛋白的表达量。(6)在激活或抑制自噬,以及抑制泛素化蛋白降解途径的不同处理组中,通过成像流式检测E2A/Pbx1与LC3和泛素化蛋白是否存在共定位现象。结果:(1)B-ALL病人骨髓样本与正常骨髓样本相比,造血干祖细胞比例明显降低,B系细胞比例明显升高。病人样本CD34+38-以及CD19+细胞中自噬相关基因的表达水平明显低于正常组。(2)NOD-SCID小鼠急淋白血病模型中,生存曲线的观察测定结果显示,对照组小鼠一直存活,模型组、预防组和治疗组小鼠平均存活时间为21.2±3.5、26.7±5.4和30±2.8天,雷帕霉素注射组可延长白血病小鼠的存活时间。外周血血常规检测结果显示,与对照组相比,模型组外周血中白细胞数目明显增加,血小板数目明显下降,而在注射雷帕霉素的两组,特别是治疗组中,雷帕霉素处理可以恢复白细胞和血小板的正常数目。肝脾病理检查结果显示,模型组肝脾肿大明显,与模型组相比,预防组和治疗组小鼠的肝脾肿大情况有所恢复,肝脏组织病理切片HE染色,模型组小鼠的肝脏组织大量白血病细胞侵润,预防组及治疗组中侵润现象明显减轻。骨髓表达外源性白血病抗原标志结果显示,与对照组相比,模型组骨髓细胞中CD45、CD19和CD10阳性的细胞比例明显增加,而预防组和治疗组中对应细胞的比例比模型组明显下降。(3)小鼠骨髓细胞的细胞周期结果显示,与对照组相比,模型组G0/G1期细胞比例明显降低,S和G2/M期细胞比例有所升高,符合肿瘤细胞生长加快特点。与模型组相比,预防组与模型组骨髓细胞的细胞周期基本无差别,而治疗组与模型组相比,其骨髓细胞G0/G1期细胞比例明显增加,S和G2/M期细胞比例明显下降,表明治疗组小鼠骨髓细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期。LSK流式细胞分析的结果显示,与对照组相比,模型组LSK细胞的数量明显减少。治疗组与模型组相比,LSK细胞比例有所升高,但无统计学差异。而在预防组中LSK(包括CD34-LSK和CD34+LSK)细胞的比例比模型组有明显的回升,并有统计学意义,表明预先注射雷帕霉素激活自噬,可以在一定程度上恢复外源性白血病细胞侵润所致小鼠造血干祖细胞数目的减少。(4)雷帕霉素处理或饥饿处理697细胞,流式细胞仪和western blot结果都显示,雷帕霉素或者饥饿处理697细胞激活自噬后,融合蛋白E2A/Pbx1含量显著下降,不仅胞质内融合蛋白含量减少,核内融合蛋白也减少。另外,NOD-SCID小鼠B-ALL模型肝脏蛋白中,与模型组相比,预防组小鼠肝脏内E2A/Pbx1的含量有所减少,而治疗组肝脏内E2A/Pbx1的含量已基本与对照组相同。激光共聚焦显微镜结果显示,融合蛋白E2A/Pbx1和GFP-LC3在雷帕霉素和饥饿处理后的细胞中出现共定位现象。(5)Western blot结果显示,3-MA抑制自噬,MG-132抑制泛素化蛋白降解,或者两者同时作用均可以引起E2A/Pbx1的积累。饥饿处理697细胞时,总泛素化蛋白含量增加,并且在饥饿处理的细胞中加入MG-132抑制泛素化过程后,融合蛋白的降解受到抑制,说明了泛素化在饥饿诱导的融合蛋白降解过程中起作用(6)成像流式细胞分析仪对不同处理组细胞进行E2A/Pbx1-LC3或E2A/Pbx1-Ub的共定位分析结果显示,饥饿或者雷帕霉素处理激活自噬引起E2A/Pbx1从核内转移至胞质,并与LC3共定位。MG-132处理可抑制饥饿引起的E2A/Pbx1的胞质聚集,并且抑制饥饿组E2A/Pbx1与Ub的共定位,而MG-132对Rap所致的融合蛋白降解及共定位无明显影响,并且对Rap及HBSS所致的LC3反应及E2A/Pbx1-LC3共定位无明显影响。结论:(1)B急淋白血病病人骨髓细胞的自噬水平降低。(2)激活小鼠自噬反应通过抑制小鼠骨髓细胞的细胞周期或恢复造血干祖细胞的数量抑制急淋白血病细胞,并且抑制白血病融合蛋白E2A/Pbx1的表达。(3)激活自噬反应抑制体外697细胞融合蛋白E2A/Pbx1的表达。在雷帕霉素激活自噬所致的融合蛋白降解过程中,细胞自噬起主要作用,而在饥饿激活自噬所致的融合蛋白降解中,细胞自噬协同泛素化过程共同起作用。