【摘 要】
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随着类弹性蛋白(ELPs)广泛的使用价值的日益显现,类弹性蛋白多肽分子在异源体内的高通量表达成为应用的瓶颈问题之一。在此我们依据人原弹性蛋白分子中在结构上最具规律性的
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随着类弹性蛋白(ELPs)广泛的使用价值的日益显现,类弹性蛋白多肽分子在异源体内的高通量表达成为应用的瓶颈问题之一。在此我们依据人原弹性蛋白分子中在结构上最具规律性的六肽重复序列(VAPGVG)以及高度分散在26A外显子亲水域的丝氨酸构建合成具有精确序列和分子量的类人弹性蛋白基因,其最终表达序列为[(VAPGVG)3S]32。利用正交实验设计的方法,通过改变明胶浓度、培养基的渗透压以及诱导时间等条件,最终我们确定在NaCl浓度为0.2M的TB培养基中添加0.5%的明胶,诱导时间为5-6h时,类人弹性蛋白基因的表达水平可提升至大肠杆菌菌体总蛋白的30%-40%之多。然后我们利用弹性蛋白本身的特性,采用温度可逆循环(ITC)的方法对其进行纯化,在相变温度(Tt)为49℃的条件下,所得蛋白的纯度可以达到80%以上。为了进一步提高所得蛋白的纯度和回收率,我们又利用传统的组氨酸标签(His-tag)亲和层析的方法对其纯化,得到了高纯度的类人弹性蛋白,纯度可达97%以上。最终确定结合缓冲液为20mM磷酸钠,0.5M NaCl,40mM咪唑,pH7.4；洗脱缓冲液为20mM磷酸钠,0.5M NaCl,500mM咪唑,pH7.4。
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