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目的:从mRNA及蛋白质水平检测微粒体前列腺素E合酶1(microsomal prostaglandin E synthase-1,mPGES-1)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织的表达,并探讨其表达与HCC临床病理特征的关系及其意义。观察mPGES-1抑制剂MK886作用后HepG2细胞mPGES-1的表达变化以及MK886对HepG2细胞增殖、黏附、侵袭及迁移能力的影响,探讨mPGES-1在HCC发展及侵袭转移中的作用。同时构建并制备携带靶向沉默mPGES-1基因shRNA的慢病毒表达载体,观察其介导的RNA干扰对HepG2细胞mPGES-1 mRNA和蛋白表达的影响,并检测靶向干扰mPGES-l后对HepG2细胞生物学行为的影响,探讨mPGES-1在HCC发展及侵袭转移中的作用。方法:(1)采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及蛋白免疫印迹(Western Blot)方法,检测60例HCC、40例相应癌旁肝组织、23例远癌肝组织、5例正常肝组织中mPGES-1 mRNA及蛋白质水平的表达,并分析mPGES-1 mRNA及蛋白质的表达与各临床病理学特征的关系,探讨其在肝细胞癌发生发展中的作用。(2)提取经不同浓度MK886作用48h后HepG2细胞的RNA和蛋白,分别用RT-PCR法及Western Blot方法检测mPGES-1mRNA和蛋白的表达情况;倒置显微镜下观察经不同浓度的MK886作用不同时间后HepG2细胞形态的变化,并采用MTT法检测细胞增殖抑制率;基质(Matrigel)黏附实验检测经不同浓度MK886作用2h后HepG2细胞粘附能力的变化;Transwell体外侵袭和迁移运动实验观察经不同浓度MK886作用24h后细胞侵袭和运动能力的变化。(3)设计并构建针对mPGES-1 mRNA的4条mPGES-1 shRNA质粒表达载体,通过Western Blot筛选最有效的序列,将筛选到的重组质粒与慢病毒包装辅助质粒pHelper 1.0,pHelper2.0共转染293T细胞,包装生产慢病毒颗粒。将重组的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,通过RT- PCR和Western Blot法检测其干扰效率;以MTT方法、透射电镜、基质黏附实验、Transwell迁移及侵袭实验检测mPGES-1基因阻断前后HepG2细胞的增殖、凋亡、黏附、迁移及侵袭能力的变化。结果:1.HCC、癌旁、远癌及正常肝组织mPGES-1 mRNA的半定量比值(mPGES-1/GAPDH)分别为0.805±0.466、0.471±0.246、0.457±0.172、0.076±0.009 , mPGES-1蛋白的半定量比值( mPGES-1/β-actin )分别为0.320±0.153、0.205±0.171、0.204±0.098、0.029±0.005。mPGES-1 mRNA及蛋白在HCC组的表达明显高于癌旁组、远癌组及正常组,差异具有统计学意义(α′=0.00714);mPGES-1 mRNA及蛋白在正常组中呈微弱表达。2. mPGES-1 mRNA及蛋白表达与HCC的病理学分级及与否包膜或脉管浸润等比较均有差异,且随HCC病理学分级的升高,其表达量明显升高( P<0.01),包膜浸润组中mPGES-1mRNA及蛋白表达量高于包膜无浸润组(P<0.01),脉管浸润组高于无脉管浸润组(P<0.01)。除外,mPGES-1的表达与性别、年龄、术前AFP、肿瘤大小和组织学类型均无关(P>0.05)。3.MK886作用48h后HepG2细胞mPGES-1 mRNA和蛋白表达均减少,随着MK886浓度的升高,mPGES-1表达逐渐下调。4.MK886作用后HepG2细胞增殖受到抑制,呈浓度及时间依赖性。MK886作用48h后,对HepG2细胞的IC50为41.42μmol/L。MK886作用后HepG2细胞皱缩变小,胞质中空泡明显增多,可见到核固缩或碎裂。随着MK886作用浓度的增加和作用时间的延长,细胞形态的变化愈加明显,细胞碎片逐渐增多,体外增殖曲线显示细胞存活率逐渐减低。5.基质(Matrigel)黏附实验显示20μmol/L、40μmol/L、75μmol/L实验组细胞黏附率分别为85.3%±1.3%、70.5%±1.5%、45.8%±2.4%,明显低于对照组100.0%±0%(F=626.313,P=0.000),呈剂量依赖性。6.迁移实验显示20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L实验组细胞24h的迁移细胞数分别为(92.47±1.90)、(62.63±1.96)、(37.33±0.83),低于对照组迁移细胞数(128.93±2.60)(F=1253.805,P<0.01)。侵袭实验显示20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L实验组细胞24h的侵袭细胞数分别为(41.67±1.30)、(25.47±1.30)、(13.93±1.66),对照组侵袭细胞数为(55.67±2.08),各组间差异均有统计学意义(F=372.615,P<0.01)。MK886作用后HepG2细胞迁移及侵袭细胞数均呈剂量依赖性。7.通过PCR筛选阳性克隆和DNA测序鉴定,结果显示4个携带靶向沉默mPGES-1基因shRNA片段的质粒构建正确,RT-PCR与Western Blot方法筛选到KD3、KD4的干扰效率最好。将KD3、KD4分别与慢病毒包装辅助质粒pHelper 1.0,pHelper 2.0共转染293T细胞,包装生产慢病毒表达载体系统LV- mPGES-1-shRNA,测定其病毒滴度均为9x108TU/mL。选取KD4进行后续实验。8. LV- mPGES-1-shRNA感染HepG2细胞,与未感染组和空载体病毒感染组相比mPGES-1 mRNA和蛋白的表达量明显下降(P<0.01)。9.与未感染组和空载体病毒感染组相比,透射电镜观察到LV-mPGES-1-shRNA组(即KD组)凋亡细胞核电子密度增加,核碎裂,可见凋亡小体,同时体外增殖、黏附、侵袭和迁移能力均不同程度的下降(P<0.01)。结论:.正常肝组织微弱表达mPGES-1,HCC高表达mPGES-1,mPGES-1表达高低与肿瘤的分化程度、侵袭转移等病理学特征有关。2.mPGES-1抑制剂MK886可剂量依赖性的下调HepG2细胞mPGES-1mRNA和蛋白的表达。其表达降低后明显抑制HepG2细胞的体外增殖能力,增殖抑制率呈明显的剂量时间依赖性。同时细胞的黏附能力、迁移运动能力和侵袭穿过Matrigel胶的能力也明显下降,呈剂量依赖性。下调mPGES-1表达预示可降低HCC侵袭转移的潜能。3.成功构建和鉴定了高滴度重组慢病毒表达载体LV-mPGES-1-shRNA,该系统具有较高的转染效率,可显著、稳定的抑制mPGES-1基因的表达,为后续肝细胞癌的相关实验研究奠定可靠的基础。4.mPGES-1基因抑制后HepG2细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭能力等恶性生物学行为均受到不同程度的抑制,同时诱导细胞凋亡,其抑制增殖、抑制侵袭转移的机制可能与下调mPGES-1的表达密切相关。