大肠癌虚实证候与蛋白质差异性表达的研究

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目的:  通过对大肠癌虚实不同证型蛋白质差异性表达的研究,从蛋白质组学角度研究虚实不同证型大肠癌的理论实质,为虚实不同证型大肠癌本质的阐述提供客观依据,同时这也将为中医基础理论、证候现代化研究及病证结合研究开辟新的思路和方法。  方法:  1、收集30例虚证(气血亏虚型)大肠癌患者及30例实证(湿热蕴结型)大肠癌患者的肿瘤组织标本,此外选取健康志愿者20人结肠粘膜作为正常对照组。  2、比较分析虚实不同证型大肠癌在性别、年龄、病程、临床症状、贫血、病变部位、内镜分型、临床病理分期、病理类型、肿瘤转移、肿瘤标志物等方面的差异。  3、对各组进行蛋白质提取、浓度测定,利用双向凝胶电泳(2-DE)即水平向的等电聚焦电泳(IEF)和垂直向的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对各组蛋白质进行分离,利用银染对凝胶进行染色,通过对凝胶图像分析,选取虚实不同证型大肠癌之间表达量差异2倍以上的点作为质谱分析的候选蛋白质点。  4、从凝胶中切出差异蛋白点,然后进行质谱鉴定。通过质谱获取蛋白质的肽质量指纹图谱(PMF),并对PMF进行数据库(NCBI和SWISS-PROT)检索得到相应蛋白质的鉴定结果。  结果:  1、虚实不同证型大肠癌在年龄、性别、病程上无明显差异(P>0.05)。虚实不同证型大肠癌均以血便为突出临床表现,在临床症状上无明显差异(P>0.05)。  2、虚实不同证型大肠癌与贫血相关,虚证大肠癌贫血较明显,而实证大肠癌无明显贫血,两者之间差异显著(P<0.01);虚证大肠癌和正常对照差异显著(P<0.05或 P<0.01),实证大肠癌与正常对照之间无显著差异(P>0.05)。  3、虚实不同证型大肠癌病变部位均以直、乙状结肠为主,病变部位无显著性差异(P>0.05)。  4、虚实不同证型大肠癌内镜分型均以肿块型为主,内镜分型无显著性差异(P>0.05)。  5、虚实不同证型大肠癌临床病理分期,Dukes A、B期大肠癌实证明显多于虚证,DukesC、D期大肠癌虚证明显多于实证,两者之间差异明显(P<0.05)。  6、虚实不同证型大肠癌的病理类型无明显差异,均以中分化管状腺癌为主,两者之间在病理类型上无明显差异(P>0.05)。  7、虚实不同证型大肠癌临床转移差异明显,虚证大肠癌临床转移明显多于实证大肠癌(P<0.05)。  8、虚实不同证型大肠癌肿瘤标志物CEA、CA125、CA199均明显升高,与正常对照比较,差异具有显著性意义(P<0.01)。虚实不同证型大肠癌肿瘤标志物AFP无明显升高,与正常对照比较,差异无显著性意义(P>0.05)。虚实不同证型大肠癌之间肿瘤标志物无显著性差异(P>0.05)。  9、通过对蛋白质分离,获得了高质量的蛋白质组2-DE图像。  10、通过对凝胶图像分析,筛选出虚实不同证型大肠癌之间具有明显表达差异的23个蛋白质斑点。  11、通过对蛋白质斑点的质谱鉴定、PMF的分析,鉴定出虚实不同证型大肠癌之间表达具有明显差异的21个蛋白质。相对于虚证大肠癌,实证大肠癌有10个蛋白质点上调,11个蛋白质点下调;反之,相对于实证大肠癌,虚证大肠癌有11个蛋白质点上调,10个蛋白质点下调。  12、通过数据库(NCBI和SWISS-PROT)检索,这21个蛋白质包括:热休克蛋白(Heat shock protein90-alpha, Heat shock protein90-beta-3, Heat shock protein beta-6,Heat shock protein beta-1),细胞骨架蛋白(Cytokeratin-10,Transgelin, Desmin),抗氧化蛋白(Glutathione peroxidase3 precursor,Peroxiredoxin-6),信号转导相关蛋白(Annexin A5, Annexin A2),参与能量产生相关蛋白(NADH dehydrogenase),血液蛋白(Serum albumin precursor,Haptoglobin precursor, Transthyretin precursor, Fibrinogen beta chain precursor),其他蛋白(Clusterin precursor,Mast cell-expressed membrane protein1,Zinc finger protein497)。  结论:  1、虚实不同证型大肠癌均以血便为突出临床表现,病变部位均以直、乙状结肠为主,内镜分型均以肿块型为主,病理类型均以中分化管状腺癌为主,两者在临床症状、病变部位、内镜分型、病理类型上无明显差异。  2、虚实不同证型大肠癌与贫血相关,虚证大肠癌贫血较明显,而实证大肠癌无明显贫血;与临床病理分期相关,Dukes A、B期实证大肠癌明显多于虚证,DukesC、D期虚证大肠癌明显多于实证;与转移相关,临床转移发生率虚证大肠癌明显高于实证;虚实不同证型大肠癌肿瘤标志物CEA、CA125、CA199较正常均明显升高,但两者之间无明显差异。  3、通过对虚实不同证型大肠癌蛋白质组的凝胶图像分析,得到23个差异表达的蛋白质。  4、通过质谱鉴定和数据库检索,共有21个差异表达蛋白质得到鉴定,包括热休克蛋白、细胞骨架蛋白、抗氧化蛋白、信号转导相关蛋白、能量产生相关蛋白、血液蛋白等。  5、通过对21个差异蛋白质功能的分析,结果显示虚证型大肠癌预后相对不良,实证型大肠癌预后相对较好,这与中医虚、实证的证型特点是一致的,也提示从蛋白质水平研究中医证型是可行的。  6、通过对虚实不同证型大肠癌蛋白质组差异表达的研究,探索大肠癌虚实不同证型与蛋白质组学之间的关系,初步建立了“大肠癌虚实不同证型-蛋白质表达谱(21个差异蛋白质)”,进一步为实现大肠癌虚实不同证型的临床辨证客观化提供了科学的依据,为研究中药治疗虚实不同证型大肠癌提供了新靶点。同时也为中医证候的客观化研究及病证结合研究提供了新的方法和手段。
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