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目的
筛选孕20周前子痫前期患者单个核细胞的环状(circular RNA )标志物；探索has-circPAPP-A系统在正常孕妇胎盘组织、子痫前期患者单个核细胞和血浆中的表达规律；为进一步建立基于has-circPAPP-A系统的子痫前期预警模型及其调控机制研究奠定基础。
方法
采用巢式病例对照研究，收集2013年4月至2015年6月在本院产检和分娩的孕妇人口学、病历资料和外周血，所有纳入研究的孕妇追踪至分娩。第一部分，环状RNA表达谱筛选：病例组和对照组(1∶1匹配)各5例，应用人环状RNA芯片技术进行检测。采用R软件包分析比较两组3569个单个核细胞中环状RNA的表达差异，应用DAVID、gooncology、KEGGPATHWAY、TargerScan、miRanda、CircBase、CircNet等生物信息学软件对差异环状RNA进行生物学功能富集和预测其吸附的微小RNA反应元件(MREs, miRNA response elements)，初步筛选PE相关的关键环状RNA以及吸附的miRNA。第二部分，提取孕8周正常孕妇人工流产绒毛组织RNA，检测候选circPAPP-A(circ0088222和circ0002052)及吸附的miRNAs(miR-195a-5p和miR-195b-5p)以及PAPP-A的mRNA表达状况；circRNA、miRNA和PAPP-A蛋白验证：将确诊为PE的30例孕妇和以年龄孕周1∶1相匹配的30例正常孕妇的血单个核细胞标本，应用QPCR法验证circPAPP-A(circ0088222和circ0002052)及吸附的miRNAs(miR-195a-5p和miR-195b-5p)表达规律；同时，将这部分PE组30例与正常组30例孕妇(同一人群)的血浆标本应用ELISA法验证PAPP-A水平。第三部分，利用第二部分表达有差异的circPAPP-A以及PAPP-A，通过多因素条件Logistic回归分析与PE发生的关联性、使用ROC曲线确定其临床预测效率，建立PE的早期新型标志物的联合预测模型。
结果
1.孕20周前子痫前期患者单个核细胞的circRNA标志物筛选：筛选出PE诊断前的2178个环状RNA表达有差异，其中hsa_circ_0006732、hsa_circ_0057552、hsa_circ_0037078、hsa_circ_0004001、hsa_circ_0092232、hsa_circ_0003410、hsa_circ_0068610、hsa_circ_0041392、hsa_circ_0002799、hsa_circ_0003489、hsa_circ_0000419、hsa_circ_0088222等1294个环状RNA在患者血中单个核细胞中表达上调；而hsa_circ_0001506、hsa_circ_0001974、hsa_circ_0000602、hsa_circ_0072788、hsa_circ_0054843、hsa_circ_0001601、hsa_circ_0001780、hsa_circ_0004855、hsa_circ_0002052、hsa_circ_0070805、hsa_circ_0052867、hsa_circ_0042817、hsa_circ_0002052等884个环状RNA在PE患者血中单个核细胞中表达下调。
2.差异环状RNA生物学功能富集和吸附的MREs预测：环状RNA主要涉及细胞生长、大分子代谢过程、细胞代谢、初级代谢过程、细胞生长的调控、细胞代谢过程调控、单个器官的代谢过程、发育等生物学过程。主要通路有：TNF信号通路、TGF-beta信号通路、脂肪酸降解及代谢、抗坏血酸代谢和药物代谢等信号通路。预测吸附的MREs的分析，确定上调的hsa_circ_0088222和下调的hsa_circ_0002052代表基因(gene sympol)为妊娠相关蛋白A(PAPP-A)，预测其吸附最相关的MREs为miR-195a-5p、miR-195b-5p。通过环状RNA相互作用网络分析确定hsa_circ_0088222和hsa_circ_0002052等环状RNA可能通过吸附miR-195a-5p、miR-195b-5p参与PE的发病。
3.Has-circPAPP-A系统在正常孕妇胎盘组织、子痫前期患者单个核细胞、血浆中的表达规律：根据差异环状RNA富集分析和预测吸附的miRNA结果，对筛选出的差异circRNA和miRNA进行验证。孕8周正常孕妇人工流产的绒毛组织中hsa_circ_0088222、miR-195a-5p、miR-195b-5p以及PAPP-A的mRNA均有表达。PE患者与正常孕妇孕8-20周单个核细胞中hsa_circ_0088222的表达水平具有显著统计学差异；根据前面验证的circ0088222的所代表的基因，对同一人群的血浆PAPP-A蛋白进行验证。PE患者孕8-20周血浆中PAPP-A的表达水平为65.78±32.50pg/ml，与对照组(39.47±23.44)相比明显增加，P值为0.001，PE患者与正常孕妇孕8-20周血浆PAPP-A的表达水平具有显著的统计学差异。
4.基于has-circPAPP-A系统的子痫前期预警模型的建立：经ROC曲线分析示：circ0088222、PAPP-A预测PE发生的曲线下面积分别为0.696和0.728。利用多指标建立联合预测模型，标志物circ0088222和PAPP-A的相关系数分别为-0.265和0.042，两者联合预测PE的曲线下面积为0.820(95%CI：0.709~0.931)；以-0.029为临界值时，预测PE发生的敏感度、特异度、阳性似然比和阴性似然比分别为76.67%、80%、3.83和0.29，预测准确率为82%。联合模型对PE具有较高预测价值，远高于单个指标的预测价值。
结论
1.孕8-20周PE组孕妇外周血中单个核细胞中2178个环状RNA可能与疾病的发生有关，证明PE是一个具有不同生物学改变的复杂疾病。
2.差异环状RNA主要涉及细胞生长、大分子代谢过程、细胞代谢、初级代谢过程、细胞生长的调控、细胞代谢过程调控、单个器官的代谢过程、发育等生物学过程；涉及TNF信号、TGF-beta信号、脂肪酸降解及代谢、抗坏血酸代谢和药物代谢等信号通路等通路。其中hsa_circ_0088222和hsa_circ_0002052等环状RNA可能通过吸附miR-195a-5p、miR-195b-5p参与PE的发病。
3.Hsa_circ_0088222与PAPP-A与PE发生具有关联性，孕8-20周联合hsa_circ_0088222与PAPP-A对PE具有较高预测价值。
4.提出PE发病的新假说，即has-circPAPP-A系统参与PE发病过程的机制调控。
筛选孕20周前子痫前期患者单个核细胞的环状(circular RNA )标志物；探索has-circPAPP-A系统在正常孕妇胎盘组织、子痫前期患者单个核细胞和血浆中的表达规律；为进一步建立基于has-circPAPP-A系统的子痫前期预警模型及其调控机制研究奠定基础。
方法
采用巢式病例对照研究，收集2013年4月至2015年6月在本院产检和分娩的孕妇人口学、病历资料和外周血，所有纳入研究的孕妇追踪至分娩。第一部分，环状RNA表达谱筛选：病例组和对照组(1∶1匹配)各5例，应用人环状RNA芯片技术进行检测。采用R软件包分析比较两组3569个单个核细胞中环状RNA的表达差异，应用DAVID、gooncology、KEGGPATHWAY、TargerScan、miRanda、CircBase、CircNet等生物信息学软件对差异环状RNA进行生物学功能富集和预测其吸附的微小RNA反应元件(MREs, miRNA response elements)，初步筛选PE相关的关键环状RNA以及吸附的miRNA。第二部分，提取孕8周正常孕妇人工流产绒毛组织RNA，检测候选circPAPP-A(circ0088222和circ0002052)及吸附的miRNAs(miR-195a-5p和miR-195b-5p)以及PAPP-A的mRNA表达状况；circRNA、miRNA和PAPP-A蛋白验证：将确诊为PE的30例孕妇和以年龄孕周1∶1相匹配的30例正常孕妇的血单个核细胞标本，应用QPCR法验证circPAPP-A(circ0088222和circ0002052)及吸附的miRNAs(miR-195a-5p和miR-195b-5p)表达规律；同时，将这部分PE组30例与正常组30例孕妇(同一人群)的血浆标本应用ELISA法验证PAPP-A水平。第三部分，利用第二部分表达有差异的circPAPP-A以及PAPP-A，通过多因素条件Logistic回归分析与PE发生的关联性、使用ROC曲线确定其临床预测效率，建立PE的早期新型标志物的联合预测模型。
结果
1.孕20周前子痫前期患者单个核细胞的circRNA标志物筛选：筛选出PE诊断前的2178个环状RNA表达有差异，其中hsa_circ_0006732、hsa_circ_0057552、hsa_circ_0037078、hsa_circ_0004001、hsa_circ_0092232、hsa_circ_0003410、hsa_circ_0068610、hsa_circ_0041392、hsa_circ_0002799、hsa_circ_0003489、hsa_circ_0000419、hsa_circ_0088222等1294个环状RNA在患者血中单个核细胞中表达上调；而hsa_circ_0001506、hsa_circ_0001974、hsa_circ_0000602、hsa_circ_0072788、hsa_circ_0054843、hsa_circ_0001601、hsa_circ_0001780、hsa_circ_0004855、hsa_circ_0002052、hsa_circ_0070805、hsa_circ_0052867、hsa_circ_0042817、hsa_circ_0002052等884个环状RNA在PE患者血中单个核细胞中表达下调。
2.差异环状RNA生物学功能富集和吸附的MREs预测：环状RNA主要涉及细胞生长、大分子代谢过程、细胞代谢、初级代谢过程、细胞生长的调控、细胞代谢过程调控、单个器官的代谢过程、发育等生物学过程。主要通路有：TNF信号通路、TGF-beta信号通路、脂肪酸降解及代谢、抗坏血酸代谢和药物代谢等信号通路。预测吸附的MREs的分析，确定上调的hsa_circ_0088222和下调的hsa_circ_0002052代表基因(gene sympol)为妊娠相关蛋白A(PAPP-A)，预测其吸附最相关的MREs为miR-195a-5p、miR-195b-5p。通过环状RNA相互作用网络分析确定hsa_circ_0088222和hsa_circ_0002052等环状RNA可能通过吸附miR-195a-5p、miR-195b-5p参与PE的发病。
3.Has-circPAPP-A系统在正常孕妇胎盘组织、子痫前期患者单个核细胞、血浆中的表达规律：根据差异环状RNA富集分析和预测吸附的miRNA结果，对筛选出的差异circRNA和miRNA进行验证。孕8周正常孕妇人工流产的绒毛组织中hsa_circ_0088222、miR-195a-5p、miR-195b-5p以及PAPP-A的mRNA均有表达。PE患者与正常孕妇孕8-20周单个核细胞中hsa_circ_0088222的表达水平具有显著统计学差异；根据前面验证的circ0088222的所代表的基因，对同一人群的血浆PAPP-A蛋白进行验证。PE患者孕8-20周血浆中PAPP-A的表达水平为65.78±32.50pg/ml，与对照组(39.47±23.44)相比明显增加，P值为0.001，PE患者与正常孕妇孕8-20周血浆PAPP-A的表达水平具有显著的统计学差异。
4.基于has-circPAPP-A系统的子痫前期预警模型的建立：经ROC曲线分析示：circ0088222、PAPP-A预测PE发生的曲线下面积分别为0.696和0.728。利用多指标建立联合预测模型，标志物circ0088222和PAPP-A的相关系数分别为-0.265和0.042，两者联合预测PE的曲线下面积为0.820(95%CI：0.709~0.931)；以-0.029为临界值时，预测PE发生的敏感度、特异度、阳性似然比和阴性似然比分别为76.67%、80%、3.83和0.29，预测准确率为82%。联合模型对PE具有较高预测价值，远高于单个指标的预测价值。
结论
1.孕8-20周PE组孕妇外周血中单个核细胞中2178个环状RNA可能与疾病的发生有关，证明PE是一个具有不同生物学改变的复杂疾病。
2.差异环状RNA主要涉及细胞生长、大分子代谢过程、细胞代谢、初级代谢过程、细胞生长的调控、细胞代谢过程调控、单个器官的代谢过程、发育等生物学过程；涉及TNF信号、TGF-beta信号、脂肪酸降解及代谢、抗坏血酸代谢和药物代谢等信号通路等通路。其中hsa_circ_0088222和hsa_circ_0002052等环状RNA可能通过吸附miR-195a-5p、miR-195b-5p参与PE的发病。
3.Hsa_circ_0088222与PAPP-A与PE发生具有关联性，孕8-20周联合hsa_circ_0088222与PAPP-A对PE具有较高预测价值。
4.提出PE发病的新假说，即has-circPAPP-A系统参与PE发病过程的机制调控。