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致泻大肠埃希氏菌(Diarrheagenic Escherichia coli,DEC)是一种重要的食源性致病菌,极易造成人体感染,感染后可引发腹痛腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒症等病症,会威胁人类健康及生命财产安全。因此,为了解决因DEC引发的食品安全问题和医疗卫生感染等问题,对DEC进行高效、快速、精准的检测已成为一个重要课题。本项目主要研发了一种DEC快速检测试剂盒,基于多重实时荧光定量PCR(multiplex real-time quantitative PCR,qPCR)的检测方法,可以做到单管qPCR反应同时对五种主要类型的DEC进行检测,包括产肠毒素大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)、肠道出血性大肠埃希氏菌(Enterohemorrhagic Escherichhia coli,EHEC)、肠道致病性大肠埃希氏菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)、肠道集聚性大肠埃希氏菌(Enteroaggregative Escherichia coli,EAEC)和肠道侵袭性大肠埃希氏菌(Enteroinvasive Escherichia coli,EIEC)。在该试剂盒的检测中,不仅可以对五种DEC的13个特征性毒力基因stp,sth,lt,stx1,stx2,eae,escV,bfpB,aggR,astA,pic,invE和ipaH单管全部检测,同时还可以对一种人工合成的内质控(internal amplification control,IAC)进行检测以监控整个PCR反应,预防出现假阴性结果。第一章,简述了 DEC快速检测试剂盒的研发过程,主要包括目标基因的选择、引物探针的设计、单重及多重qPCR的优化及实验结果等。第二章,主要描述了商用质粒之间交叉污染的发现、验证与再纯化,以及对DEC快速检测试剂盒的性能评价,包括灵敏性、特异性及抗干扰能力等。从实验结果可得,该试剂盒的检测灵敏性高,单个基因的检测极限可达10拷贝每反应,PCR效率高(96%-110%)、线性关系好(R2 ≥ 0.99)、可实现高度定量检测,检测特异性强,抗干扰能力强。在存在高于检测靶标10000倍竞争模板情况下,100拷贝每反应的靶标基因与没有竞争模板的检测Ct值差在±2.3之间,即对模板的检测误差在5倍以内。第三章,介绍了 DEC快速检测试剂盒的应用研究,包括成功区分活菌和死菌及随机选择的食品样本检测。在模拟活菌和死菌检测中,该试剂盒可以在4个小时内成功区分万分之一活菌;在食品样本检测中,随机选择219个未经加工食品样本,检出被DEC污染的就有20个,被污染率高达9.1%,说明对食物高温杀菌的必要性及检测的重要性。综上所述,利用多重实时荧光定量PCR的方法,成功的研发出一种DEC快速检测试剂盒,可以单管同时检测五种DEC的13个特征性毒力基因,具有检测灵敏性高、特异性强和快速判读活菌和死菌等优势。现已成功应用于食品样本的DEC污染检测,预计未来也可以应用于临床样本检测,其推广应用可能成为一个预防DEC相关疾病和改善公共健康问题的强有力工具。