普遍认为噪音,耳毒性药物,老化以及各种疾病引起的毛细胞的缺失,变性,损伤是感音神经性聋的主要原因。但是毛细胞是位于内耳感觉上皮的终末分化细胞,以往的研究表明哺乳类耳蜗毛细胞损伤后是不能再生的。长期以来人们为了探讨毛细胞发育、分化、再生的机制而进行了不懈的努力,刺激毛细胞的再生从而修复受损的听力及平衡障碍一直是研究的主要方向。 再生可能是重复正常发育中的毛细胞分化的过程。因此,理解毛细胞的分化有助于毛细胞再生的研究。哺乳类前庭毛细胞的发生也以与低等脊椎动物相似的方式源自感觉上皮内的前体细胞和支持细胞,但哺乳类耳蜗毛细胞的确切起源还不清楚,组织学研究表明内、外毛细胞在胚胎发育过程中可能分别起源于大、小上皮嵴。 最近,大上皮嵴(greater epithelial ridge,GER)成为哺乳动物毛细胞再生研究的一个新热点。研究表明,大上皮嵴很可能是毛细胞的前体细胞群之一。毛细胞分化的正性调控基因Math1在体外培养的大鼠耳蜗中过度表达后,能诱导大上皮嵴形成大量新生毛细胞。一些参与毛细胞分化和再生的重要基因和生长因子受体如P27、Hes1、Math1和FGFR1等在不同时期的大上皮嵴表达,这些研究结果都表明大上皮嵴在毛细胞的分化和再生过程中起着重要的作用,是重要的细胞群,有可能是耳蜗毛细胞的前体细胞池之一。目前对大上皮嵴了解的不多,本课题的目的在于探讨利用酶消化和机械解剖相结合的方法分离出有活性的大上皮嵴。通过形态学比较,免疫组织化学染色,RT-PCR对所分离的大上皮嵴进行鉴定,原代培养以验证分离的大上皮嵴活性。 一、大鼠耳蜗大上皮嵴的分离 选取出生后0天的SD大鼠耳蜗,取出基底膜,将其放入含有嗜热菌蛋白酶和少许DNA酶的D-Hank’s溶液中,37℃孵箱孵育25分钟进行酶消化,然后在高倍显微镜下进行机械分离。经过酶的作用后,耳蜗上皮组织和结缔