本研究从浙江省主要养鸭地区分离到13株鸭疫里默氏杆菌和19株大肠杆菌,药敏试验结果表明浙江省各地区鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌耐药情况非常严重,其中鸭疫里默氏杆菌总体上对多粘菌素、卡那霉素、丁胺卡那、庆大霉素、复方新诺明等药物的耐药性很严重;大肠杆菌的耐药情况更为严重,大肠杆菌总体上对红霉素、麦迪霉素、氟哌酸、氨苄青霉素、青霉素G、林可霉素、阿莫西林、链霉素等药物的耐药性很严重。鸭疫里默氏杆菌总体上可耐受6种抗生素,占抗生素种类的比例为31.6 %;大肠杆菌更是达到了总体上可耐受11种抗生素,占抗生素种类的比例为57.9 %,如此严重的多重耐药性必将给防治带来很大的困难。为发展细菌原生质体融合技术,探索研制细菌多联菌苗的新方法、新途径,本研究选用鸭疫里默氏杆菌和鸭大肠杆菌的优势血清型TXRA1和ZBO78进行融合试验,并用氯霉素(Chl)、红霉素(Ery)对其进行抗药性诱导培育出耐药标记菌株鸭疫里默氏杆菌TXRA1(Chlr,Erys)和鸭大肠杆菌ZBO78(Eryr,Chls)菌株。试验目的是摸索该菌株的原生质体制备和再生的条件并进行优化,培育双价融合菌株为预防这两种疾病提供新方法。通过优化Lysozyme-EDTA的工作时间和作用浓度,最后确定鸭疫里默氏杆菌TXRA1以Lysozyme0.1 g/L作用20 min后补加EDTA至终浓度为0.01 mol/L继续作用作用45 min为最佳试验条件,并成功获得了92 %的原生质体制备率;鸭大肠杆菌ZBO78以Lysozyme 0.2 g/L作用20 min后补加EDTA至终浓度为0.01 mol/L继续作用16 min为最佳试验条件,并成功获得了91.94 %的原生质体制备率。通过进一步优化原生质体的制备方式、高渗悬浮缓冲液以及高渗再生培养基中的蔗糖浓度、琼脂浓度、pH值、离子浓度等因素,鸭疫里默氏杆菌TXRA1成功获得了38.77 %的原生质体再生率;鸭大肠杆菌ZBO78成功获得了37.29 %的原生质体再生率。根据对鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌原生质体的制备和再生条件的优化后的最佳条件,我们应用PEG法成功地构建了鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌双型融合菌株,获得了31株具有双亲菌株耐药性的双型融合菌株。鉴于试验所得到的31株融合子能够发生自凝现象,本试验建立了基于两亲本菌株部分外膜蛋白(ompA)为靶基因的双重PCR检测方法,经双重PCR扩增后其中有11株融合菌株能够表达两亲本的ompA基因,有20株仅表达亲本大肠杆菌的ompA基因,另外实验过程中加入Dnase I排除外源DNA的转化,说明两亲本菌株发生了融合和染色体基因重组。融合菌株扩增出的670 bp和408 bp的目的片段经测序后与亲本菌株TXRA1和ZBO78的序列经比对分析,同源性均为100 %,说明经双重PCR扩增出的条带是我们的目的片段,亦证明试验所得到的融合菌株发生了了真正的融合。本研究确定了11株能够表达两亲本菌株基因组的阳性融合子,在国内外尚属首次,既发展了细菌原生质体融合技术,又为研制鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌融合双联弱毒菌苗奠定了基础,也为进一步研制细菌多联高效弱毒菌苗提供了新方法。对于试验中另外20株只表达亲本大肠杆菌ompA基因的融合菌株不一定就是阴性融合子,可能是其基因组发生了其它的重组方式,而我们设计的引物无法检测其它的重组片段。本试验建立的对融合菌株进行鉴定的双重PCR检测方法,可为其它融合试验所借鉴。