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目的:对正常及脾虚小鼠经口感染白色念珠菌,通过检测小鼠粪便中活菌数和小肠组织病理改变,观察脾虚小鼠对白色念珠菌的易感性;通过检测小肠黏膜固有层CD4+T和CD8+T细胞亚群分布,分析脾虚小鼠经口感染白色念珠菌对CD4+T和CD8+T细胞亚群分布的影响;通过检测小肠组织中IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γm RNA及蛋白表达水平,推测脾虚小鼠感染白色念珠菌后Th1/Th2平衡的变化;通过检测小肠组织中穿孔素、颗粒酶基因及蛋白表达水平,阐述经口感染白色念珠菌小鼠CTL细胞通过穿孔素/颗粒酶途径杀伤靶细胞的机制。材料与方法:健康SPF级昆明种小白鼠60只,随机分为两组:空白组(30只)和脾虚造模组(30只)。对脾虚造模组小鼠采用饮食失节加劳倦过度的方法制备脾虚小鼠模型。模型制备成功后,再次将空白组小鼠随机均分为2组:正常对照组和正常+白色念珠菌组;将脾虚造模组小鼠随机均分为2组:脾虚模型组和脾虚+白色念珠菌组。实验第1天起,采用的饮食失节加劳倦过度复合因素造模法制备小鼠脾气虚泄泻模型。给脾虚造模组小鼠单日喂饲甘蓝,并强制性游泳至耐力极限(指小鼠游泳至无力游动,经驱赶仍不能继续游动,且出现身体向腹侧蜷曲、发抖、欲溺水等征象);双日施加猪油0.2m L/10g体重,灌胃,并正常进食,连续14天。正常对照组小鼠正常饲养。实验14天后,按照脾虚模型宏观诊断标准对脾虚造模组小鼠进行模型评价。脾虚模型制备成功后,次日对正常+白色念珠菌组和脾虚+白色念珠菌组小鼠经口感染白色念珠菌,白色念珠菌浓度为2×108/m L,剂量为0.2m L/10g体重,正常对照组和脾虚模型组小鼠给予等量生理盐水经口灌胃,染菌后,各组小鼠均正常饲养,至实验第35天,即染菌后的第21天,处死各组小鼠,进行相关指标检测。采用HE染色及电镜的方法,观察小鼠小肠黏膜的病理变化及超微结构改变;检测粪便中活菌数及念珠菌种类;采用流式细胞术检测各组小鼠小肠黏膜固有层中T淋巴细胞亚群的分布;采用western-blot法和RT-PCR法检测各组小鼠小肠组织中IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ蛋白及基因表达水平;采用western-blot法、免疫荧光法和RT-PCR法检测各组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme蛋白及基因表达水平。结果:1.各组小鼠小肠黏膜形态学改变:正常对照组小鼠小肠黏膜完整,绒毛排列整齐,肌层薄厚均匀适中。脾虚模型组小鼠与正常对照组比较,小肠黏膜比较完整,偶见小肠绒毛排列不整齐等改变。正常+白色念珠菌组和脾虚+白色念珠菌组小鼠均显示出不同程度的病变,尤以脾虚+白色念珠菌组小鼠病理改变最为明显,主要表现为绒毛缺失,排列不整齐,黏膜下层有炎性细胞浸润。2.各组小鼠小肠超微结构改变:正常对照组小鼠小肠微绒毛排列整齐,细胞内细胞器丰富,线粒体、内质网、核糖体清晰可见。脾虚模型组小鼠小肠微绒毛略短,但排列尚比较整齐。正常+白色念珠菌组小鼠小肠微绒毛稀疏,长短不一,细胞质内线粒体肿胀、偶见空泡样改变。脾虚+白色念珠菌组小鼠小肠微绒毛明显减少,排列紊乱,线粒体明显肿胀,嵴消失,呈空泡样改变,内质网扩张,表面核糖体脱落。3.各组小鼠粪便中活菌数检测结果显示:与正常对照组比较,脾虚模型组、脾虚+白色念珠菌组小鼠粪便中活菌数显著增高(P<0.01或P<0.05),有统计学差异,与脾虚模型组比较,脾虚+白色念珠菌组小鼠粪便中活菌数显著升高(P<0.01),有统计学差异。4.各组小鼠粪便中念珠菌种类检测结果显示:正常对照组热带念珠菌和克柔念珠菌偶有生长,检出率均为10%。正常+白色念珠菌组小鼠粪便中以白念菌检出率最高,为50%,光滑念珠菌检出率为20%,克柔念珠菌检出率为10%。脾虚模型组小鼠以热带念珠菌检出率最高,为30%,其次为光滑念珠菌,为20%。脾虚+白色念珠菌组小鼠以白色念珠菌检出率最高,为40%,其次为光滑念珠菌(30%)和克柔念珠菌(20%)。5.各组小鼠肠黏膜固有层CD3+T细胞的检测结果显示:各组小鼠肠黏膜固有层CD3+T细胞组间比较无统计学差异。与正常对照组比较,正常+白色念珠菌组、脾虚模型组及脾虚+白色念珠菌组小鼠小肠黏膜固有层中CD4+T细胞比例均不同程度下降。与正常+白色念珠菌组比较,脾虚+白色念珠菌组小鼠小肠黏膜固有层CD4+T细胞百分比显著下降(P<0.01)。与脾虚模型组比较,脾虚+白色念珠菌组小鼠小肠黏膜固有层CD4+T细胞百分比显著下降(P<0.01)。正常对照组、正常+白色念珠菌组、脾虚模型组间比较,小鼠小肠黏膜固有层中CD8+T细胞比例无统计学差异,但均与脾虚+白色念珠菌组比较,有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。与正常对照组比较,其余三组小鼠小肠黏膜固有层中CD4+T/CD8+T比值均有不同程度下降,有显著性差异(P<0.01);正常+白色念珠菌组与脾虚+白色念珠菌组比较,有统计学差异(P<0.01);脾虚模型组与脾虚+白色念珠菌组比较,有统计学差异(P<0.01)。6.各组小鼠小肠组织中IFN-γm RNA及蛋白的表达水平显示:与正常对照组比较,正常+白色念珠菌组、脾虚模型组、脾虚+白色念珠菌组小鼠小肠组织中IFN-γm RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与正常+白色念珠菌组比较,脾虚模型组IFN-γm RNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.01),而脾虚+白色念珠菌组IFN-γm RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与脾虚模型组比较,脾虚+白色念珠菌组IFN-γm RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。7.各组小鼠小肠组织中IL-4 m RNA及蛋白表达水平检测结果显示:与正常对照组比较,正常+白色念珠菌组、脾虚模型组、脾虚+白色念珠菌组小鼠小肠组织中IL-4 m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与正常+白色念珠菌组比较,脾虚模型组及脾虚+白色念珠菌组IL-4 m RNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与脾虚模型组比较,脾虚+白色念珠菌组IL-4 m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。8.各组小鼠小肠组织中IL-12 m RNA及蛋白表达水平检测结果显示:与正常对照组比较,正常+白色念珠菌组、脾虚模型组、脾虚+白色念珠菌组小鼠小肠组织中IL-12 m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与正常+白色念珠菌组比较,脾虚模型组IL-12 m RNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.01),而脾虚+白色念珠菌组IL-12 m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与脾虚模型组比较,脾虚+白色念珠菌组IL-12 m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01或0.05)。9.各组小鼠小肠组织中IL-10 m RNA及蛋白表达水平检测结果显示:与正常对照组比较,正常+白色念珠菌组、脾虚模型组、脾虚+白色念珠菌组小鼠小肠组织中IL-10 m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与正常+白色念珠菌组比较,脾虚模型组及脾虚+白色念珠菌组IL-10 m RNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与脾虚模型组比较,脾虚+白色念珠菌组IL-10 m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01或0.05)。10.各组小鼠小肠组织中Perforin m RNA及蛋白的表达水平结果显示:与正常对照组比较,正常+白色念珠菌组、脾虚模型组、脾虚+白色念珠菌组小鼠小肠组织中Perforin m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与正常+白色念珠菌组比较,脾虚模型组Perforin m RNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.01),而脾虚+白色念珠菌组Perforin m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与脾虚模型组比较,脾虚+白色念珠菌组Perforin m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。11.各组小鼠小肠组织中Granzyme B m RNA及蛋白表达水平检测结果显示:与正常对照组比较,正常+白色念珠菌组、脾虚模型组、脾虚+白色念珠菌组小鼠小肠组织中Granzyme B m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与正常+白色念珠菌组比较,脾虚模型组Granzyme B m RNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.01或P<0.05);与脾虚模型组比较,脾虚+白色念珠菌组Granzyme B m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。结论:1.脾虚证小鼠肠道念珠菌群紊乱。经口感染白色念珠菌后,粪便活菌数明显增加,加重肠道的念珠菌群紊乱及小肠组织的病理改变。2.脾虚小鼠的CD4+T/CD8+T比例发生改变。经口感染白色念珠菌后,CD4+T、CD8+T亚群分布变化更为明显,机体的免疫功能受损更为明显。3.白色念珠菌感染时,机体的体液免疫及细胞免疫功能均发生变化,但以细胞免疫为主。4.经口感染白色念珠菌可引起小鼠小肠局部CTL的活化,导致Perforin和Granzyme表达水平的升高。脾虚加重了机体白色念珠菌感染病情,Perforin和Granzyme高表达水平可能是脾虚小鼠感染白色念珠菌的发生机制之一。