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胚胎干(embryonic stem，ES)细胞是能在体外自我更新并具有多分化潜能的细胞，可分化为功能性心肌细胞，应用于心脏发育生理学、心脏病理学及新药发现等研究。本课题前期研究发现淫羊藿苷（icariin，ICA）能够通过激活活性氧(reactive oxygen species，ROS)信号通路促进小鼠ES细胞分化为心肌细胞，但关于ICA如何促ROS生成的作用机制还知之甚少。同时，本课题组前期利用蛋白组学技术研究了ICA促ES细胞成心体系中整套蛋白表达谱及功能，但对ICA促心肌分化是否涉及转录后调控和翻译后修饰尚不清楚。本研究主要目的是从转录后调控和翻译后修饰层面进一步论证ICA的促分化作用，揭示其促心肌分化的启动机制，为阐明其诱导分化机理作用提供实验依据，也为发展其新的应用提供理论依据。 鉴于NADPH氧化酶(NADPH oxidases，NOXs)产生的ROS在ES细胞心肌分化中发挥关键作用，课题组前期研究了其中的一个亚型NOX4在ICA促心肌分化中的作用。研究发现除了NOX4的激活不需要胞浆亚基外，其它亚型激活都需要胞浆亚基，但其它亚型NOXs在ES细胞分化心肌中是否被激活，及激活所涉及必需胞浆亚基尚不清楚。作为NADPH氧化酶的胞浆亚基，Rac1异戊烯化修饰后锚着在细胞膜上对ROS生成至关重要。此外，Rac1与其他胞浆亚基，如p67phox结合也是NOX激活产生ROS的关键一步。据此，本研究第一部分提出了Rac1异戊烯化激活是ICA促ES细胞心肌分化的早期分子事件假说;并运用siRNA沉默Rac1（si-Rac1）、Rac1CAAX残基缺失(Rac1△)质粒、牛儿基转移酶-Ⅰ(geranylgeranyl transferases type-Ⅰ，GGTase-Ⅰ)抑制剂GGTI-298，法尼基转移酶（famesyl transferase，FTase）抑制剂FTI-277和Rac1-GTP装载抑制剂NSC23766四步法，从翻译后修饰层面探索ICA促心肌分化的可能机理。 近年来，众多研究显示微小RNA(microRNAs，miRNAs)在ES细胞心肌分化中发挥重要调控作用。基于miRNAs芯片分析，我们发现miR-126在ICA促ES细胞心肌分化中显著上调，且其拟似物或拮抗剂可分别增强或削弱心肌分化作用，提示miR-126在心肌分化过程中发挥关键作用。文献报道，miR-126可提高血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的促血管生成作用，且VEGF与ROS形成密切相关。另有研究报道，分化d4 Flk-1+（Flk-1阳性）细胞高表达miR-126。因此，本研究第二部分提出miR-126通过调节VEGF及其受体Flk-1介导Rac1-p67phox复合物在细胞膜上锚着，进而激活ROS产生这一假说;并运用miR-126拟似物，miR-126拮抗剂，siRNA沉默Flk-1和Flk-1抑制剂SU5416从转录后调控层面探索ICA促心肌分化的可能机理。 ROS-Ca2+信号作为可兴奋细胞的重要生命活动，对心肌细胞正常生理功能的维持举足轻重。有研究报道在血管细胞中ROS可以激活内质网钙调控蛋白。内质网作为胞内重要的钙储存细胞器，参与调节胞内钙平衡，调控各种信号通路。内质网中的钙离子动态平衡过程由兰尼碱受体（ryanodine receptors，RyRs）、IP3受体（inositol(l)，4，5-triphosphate receptors，IP3Rs）以及肌浆（内质）网Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)协调运作控制。因此，本研究第三部分探索了miR-126-Rac1/p67phox-ROS-Ca2+信号通路在ICA促ES细胞心肌分化中的作用。 1.Rac1异戊烯化激活介导ICA促ES细胞心肌分化研究 为探索Rac1异戊烯化激活是否介导ICA促ES细胞心肌分化过程，本研究首先考察了Rac1异戊烯化激活对ICA促ROS生成的调控作用，采用ROS荧光染料DCF-DA检测了si-Rac1，Rac1△质粒，GGTI-298，FTI-277和NSC23766对ICA促拟胚体（embryoid bodies，EBs）内ROS水平影响。Western blot检测ICA对Rac1从胞浆向胞膜移位的影响。免疫荧光法检测Rac1△对心肌特异性肌小节蛋白α-辅肌动蛋白(α-actinin)的影响。 实验结果显示，ICA作用EBs0.5，1，2，4h能时间依赖性诱导Rac1从胞浆向细胞膜移位，当用si-Rac1，Rac1△，GGTI-298或NSC23766时，ICA促ROS产生作用消失，但是FTI-277却无此作用。si-Rac1，Rac1△，GGTI-298或NSC23766均能显著抑制ICA促ES细胞心肌分化作用，表现为心肌分化率降低，心肌转录因子Nkx2.5和心肌小节蛋白α-actinin表达减少，但FTI-277并不能抑制ICA促分化作用。本实验结果提示Rac1 CAAX端被20碳牛儿基异戊烯化激活，调节ROS生成介导ICA促ES细胞心肌分化过程。 2.miR-126参与VEGF及其受体Flk-1激活介导ICA促ES细胞心肌分化研究 第一部分研究了ROS上游靶点Rac1激活在ICA促ES细胞心肌分化中的作用，基于上述研究结果，为进一步明确ROS上游信号分子在ICA促ES细胞心肌分化中的角色，本部分着重对miR-126，VEGF及Flk-1进行了考察。采用Western blot法检测ICA对VEGF和Flk-1表达的影响。miRNAs芯片技术检测ICA介入后miRNAs差异表达谱。进一步利用Flk-1抑制剂SU5416，siRNA沉默Flk-1（si-Flk-1），miR-126拟似物和miR-126抑制剂研究miR-126介导VEGF及其受体Flk-1对ICA促ES细胞心肌分化的影响。 实验结果显示，VEGF在d5 EBs时高表达，随着EBs向心肌细胞分化，VEGF显著下调(d5～d5+3)，之后VEGF表达相对不变。Flk-1在整个分化过程中都有表达。ICA作用3天后能一定程度上增加VEGF表达。MTT结果显示，5μM，2.5μM和1μM SU5416对ES细胞均无增值抑制作用。在d5 EBs时加入5μM，2.5μM或1μM SU5416并不能抑制ES细胞自发的心肌文化，表现为心肌分化率增加，α-actinin表达上调。但在d0加入1μM SU5416就可以显著抑制ES细胞自发的心肌文化和ICA促ES细胞心肌文化，表现为心肌分化率降低，Nkx2.5和α-actinin表达减少。 miRNAs芯片结果显示，在d5+3，ICA可以诱导miR-126表达增加2.115倍。qRT-PCR结果确证了miR-126的差异表达。ES细胞转染miR-126拟似物可以促进其分化为心肌细胞，表现为心肌分化率增加，VEGF，Nkx2.5和α-actinin表达上调，Rac1-p67phox复合物形成和ROS生成增多。ES细胞转染miR-126抑制剂可以抑制ICA促ES细胞心肌文化，表现为心肌分化率降低，VEGF，Nkx2.5和α-actinin表达下调，Rac1-p67phox复合物形成和ROS生成减少。本实验结果提示miR-126通过调节VEGF及其受体Flk-1介导Rac1-p67phox复合物在细胞膜上锚着，进而激活ROS产生。 3.miR-126-Rac1/p67phox-ROS-Ca2+信号通路在ICA促ES细胞心肌分化中作用研究 在第一部分和第二部分的基础上，为进一步明确ROS下游信号分子在ICA促ES细胞心肌分化的作用，第三部分着重对Ca2+和内质网钙调控蛋白进行了考察。采用荧光光度法测定EBs内Ca2+浓度;免疫荧光双染法测定内质网钙调控蛋白RyR2，IP3R2或SERCA2与α-actinin共定位情况;Western blot法测定RyR2，IP3R2和SERCA2表达;活细胞工作站测定Ca2+瞬变。 实验结果显示，ICA能增加d5 EBs内Ca2+浓度，提高心肌分化过程中RyR2，IP3R2和SERCA2表达水平;在d5+7上述内质网钙调控蛋白与α-actinin均有较好的共定位;ICA尚能提高d5+11（分化末期）心肌细胞内Ca+瞬变幅度。miR-126抑制剂可抑制ICA促ROS生成，进而下调上述作用。 结论: 1.Rac1 CAAX端被牛儿基（20碳）异戊烯化激活是ICA促ES细胞心肌分化的早期分子事件，该作用与其锚着细胞膜并与p67phox结合激活NOXs促ROS生成相关。 2.ICA促分化早期miR-126可能经由VEGF/Flk-1信号参与Rac1-p67phox复合物在细胞膜上聚集，激活NOXs而促ROS生成。 3.ROS-Ca2+信号介导ICA促心肌分化过程，miR-126抑制剂通过抑制ROS生成导致分化早期EBs内Ca2+浓度降低，分化中期内质网钙调控蛋白表达下调和分化末期心肌细胞内Ca2+瞬变幅度减小。