【摘 要】
:
“大理石”花纹比例是影响牛肉品质的重要因素,也是肉牛肉用选育的重要目标之一。在分子水平上探索牛脂肪细胞分化的调控机制,能够为肉牛肉用选育提供有力的理论依据。Micro RNAs(miRNAs)是一类非编码的短片段RNA,主要通过转录后调控机制靶向抑制功能基因的表达,进而广泛参与各种细胞生命活动。自2004年miR-143被发现能够促进脂肪细胞分化以来,越来越多的miRNAs被发现参与了脂肪细胞分化
【基金项目】
:
国家科技支撑计划(2015BAD03B04); 国家重点研发计划(2018YFD0501700); 国家肉牛牦牛产业技术体系(CARS-37); 陕西省农业科技创新转化项目(NYKJ-2018-LY09);
论文部分内容阅读
“大理石”花纹比例是影响牛肉品质的重要因素,也是肉牛肉用选育的重要目标之一。在分子水平上探索牛脂肪细胞分化的调控机制,能够为肉牛肉用选育提供有力的理论依据。Micro RNAs(miRNAs)是一类非编码的短片段RNA,主要通过转录后调控机制靶向抑制功能基因的表达,进而广泛参与各种细胞生命活动。自2004年miR-143被发现能够促进脂肪细胞分化以来,越来越多的miRNAs被发现参与了脂肪细胞分化调控。作为与miR-143同簇的miR-145,在多个已发表的研究中显示具有脂肪组织特异高表达和脂肪细胞分化过程差异表达的特点。而目前,miR-145在脂肪细胞分化过程中的调控作用和调控网络鲜有报道。本研究以秦川牛前体脂肪细胞为研究材料,尝试探索miR-145上下游调控网络参与牛脂肪细胞分化的潜在机制。首先通过qRT-PCR技术检测了秦川牛各个组织和前体脂肪细胞分化过程中miR-145的表达模式,评估了miR-145作为调控牛脂肪分化候选基因的潜力。基于此,借助腺病毒介导的基因功能获得和缺失方法,明确了miR-145对牛前体脂肪细胞分化的影响。同时,本研究结合RNA-seq测序分析和靶基因预测分析,进一步探究了牛前体脂肪细胞中miR-145调控的潜在主要通路和关键靶基因,并通过双荧光素酶活性分析和western blot分析初步验证了miR-145参与牛前体脂肪细胞分化调控的分子机制。最后,本研究通过5’RACE实验、CHIP-seq数据整合分析、转录因子结合位点预测、双荧光素酶活性分析和EMSA实验等手段确定了调控牛miR-145基因表达的上游转录因子。主要研究结果如下:(1)MiR-145基因在牛各个组织中广泛表达,尤其在背最长肌、心脏、皮下脂肪、肝脏和肾周脂肪中表达较高。而且,在牛前体脂肪细胞分化过程中,miR-145基因呈现下调趋势,在分化第八天表达量最低。根据该结果,本研究选定miR-145作为调控牛前体脂肪细胞分化的候选基因。(2)构建了稳定表达的以牛miR-145基因前体序列为插入片段的重组腺病毒过表达载体和成熟序列8×sponge为插入片段的重组腺病毒干扰载体。过表达和干扰实验证实,miR-145能够显著抑制牛前体脂肪细胞分化,而对增殖和凋亡没有显著影响。该结果表明miR-145在牛前体脂肪细胞生命活动进程中主要发挥负向调控分化的作用。(3)RNA-seq测序分析结果显示,在牛前体脂肪细胞中过表达和干扰miR-145引起的差异表达基因主要富集在PI3K/Akt通路和MAPK通路,该结果与miR-145预测靶基因的富集结果较为一致。且PI3K/Akt通路关键基因IRS1和MAPK通路关键基因NRAS及它们的共同上游基因IGF1R均被证实是miR-145的靶基因。(4)在牛前体脂肪细胞分化过程中,miR-145不仅显著抑制IGF1R、IRS1和NRAS基因的蛋白表达,也显著抑制Akt和ERK1/2蛋白的磷酸化水平。胰岛素作为PI3K/Akt通路和MAPK通路的活化剂,能够拯救过表达miR-145引起的Akt和ERK1/2蛋白磷酸化水平下调。该结果表明miR-145通过下调PI3K/Akt通路和MAPK通路磷酸化水平进而抑制牛前体脂肪细胞分化。(5)通过5’RACE确定了牛miR-145基因转录起始位点(TSS)位于该基因上游1353bp处。通过公共CHIP-seq数据整合分析和转录因子结合位点预测,发现牛miR-145基因上游1954 bp处(-601)和2231 bp处(-878)存在保守的潜在C/EBPβ结合位点。(6)下调C/EBPβ的表达后,可引起miR-145表达水平和miR-145启动子活性显著提高。启动子区缺失载体活性检测结果表明,-601处的潜在C/EBPβ结合位点影响牛miR-145基因启动子转录活性。EMSA实验进一步验证了C/EBPβ结合于牛miR-145基因启动子区。本研究显示转录因子C/EBPβ靶向结合在牛miR-145基因启动子区,是牛miR-145基因表达的负调控因子。综上,本研究以miR-145对牛前体脂肪细胞分化表型的负向影响为切入点,证实了miR-145靶向抑制IGF1R、IRS1和NRAS并下调PI3K/Akt通路和MAPK通路磷酸化水平,且该调控关系可能是miR-145抑制牛前体脂肪细胞分化进程的主要原因。其次,鉴定了牛miR-145基因的转录起始位点并确认了脂肪细胞分化关键转录因子C/EBPβ是牛miR-145基因的转录抑制因子。初步探讨了牛前体脂肪细胞中miR-145的上下游调控关系,较为系统地探究了miR-145在脂肪分化调控网络中的角色和定位,为后续更为深入的研究奠定了理论基础。
其他文献
小麦是世界上最重要的粮食作物之一,也是通过异源多倍化实现物种形成的经典模式。普通小麦的形成通过两次杂交和多倍化(异源多倍化)事件,第一次是36-70万年前二倍体小麦Triticum urartu(2n=2x=14,AA)与山羊草属(Aegilops)的Sitopsis section(2n=2x=14,SS≈BB)的物种杂交加倍形成异源四倍体小麦;第二次是大约8千年前一个驯化的四倍体小麦(T.tu
近年来,随着我国经济和城市化进程的快速发展,各种污染物排放强度和范围也日益增加,我国大部分地区面临着严峻的空气污染问题。空气污染的相关研究主要集中在经济较为发达的华北平原、长三角和珠三角等地区,经济欠发达地区空气污染的现状及来源方面的研究刚刚起步、相对薄弱。本文首先以陕西省为研究对象,分析不同季节陕南、关中和陕北三个区域城市间污染物浓度的时空差异以及区域城市内不同污染物的关系,并进一步探讨造成污染
由条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的小麦条锈病是世界范围内小麦产区的一种重要真菌性病害,近年来有逐渐加重的趋势。培育和种植抗病品种是最经济、有效、安全的条锈病防治策略。研究小麦抗病相关基因的功能,可为抗病品种的培育以及改良提供理论依据,但是小麦抗条锈病机理尚不完全清楚。微丝骨架是广泛存在于真核细胞中的动态网状纤维结构,在植物感知外界刺激以及抵抗病
肉桂酸酯及其衍生物是一类具有C6-C3结构单元的苯丙素类化合物,广泛存在于植物中。该类化合物具有抗癌、杀虫、抗菌、抗氧化、抗病毒和肝保护等多种生物活性,并且具有低毒和环境友好等优点。该类化合物已经引起药物学家的的广泛关注。到目前为止,关于肉桂酸酯及其类似物杀螨和抗植物病原菌活性及其构效关系的系统研究报道尚属空白。为了进一步拓展肉桂酸酯及其衍生物的药理活性并发现具有潜在应用价值的高活性的分子,本研究
结肠癌是世界第三大恶性肿瘤,是导致人类死亡的高发性恶性肿瘤之一。其在分子特点、对放疗和化疗的反应、临床表现和疾病的预后方面都存在差异。随着人们生活方式和饮食结构的改变,结肠癌的发病率呈上升趋势。人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL(TNF Related Apoptosis Inducing Ligand)是肿瘤坏死因子超家族的成员之一。它被认为是治疗恶性肿瘤的有效药物。TRAIL的耐药性是影
石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance,QCM)生物传感器具有实时监测并且无需标记的优势,已被广泛应用于生物技术、环境监测、药物研发、疾病诊断和食品安全检测等多个领域。在QCM传感芯片表面进行不同的修饰,可形成与目标分子互相作用的功能化表面,使生命科学研究中的分析过程集成在传感芯片上完成,是检测技术的核心。通过QCM传感芯片实现对蛋白质、糖类、凝集素及其他生物组分快
近年来,物联网、人工智能、可穿戴电子等科技的崛起对传感器提出了更高水平的需求。其中,气体传感器的发展进入到了微型化、智能化和多功能化的新阶段。有机场效应晶体管(Organic Field-Effect Transistor,OFET)相比于传统的电阻型器件,由于其小尺寸、高集成、低成本、易制备、室温工作,同时兼具多参数检测、信号放大和材料结构可设计等独特优势,在当前气体传感的研究中备受关注。目前,
乳腺癌已成为全球女性人群中发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。为了给临床生物靶向治疗提供药物靶点,乳腺癌发生的分子机制研究具有重大的理论指导意义。诱导乳腺癌发生的转基因小鼠模型为研究其机理最常用的工具。催产素受体(Oxytocin Receptor,OXTR)是一个含有7个跨膜结构域的G蛋白偶联受体,其主要表达在哺乳动物的乳腺、肾脏、子宫肌层、心肌、血管内皮层和特定的脑区域,主要生物学功能为参与母性行为
肌肉生长抑素(mystatin,MSTN)作为骨骼肌生长发育的负调控因子,其表达能够显著抑制肌肉的生长发育。MSTN基因在哺乳动物进化过程中高度保守,其功能缺失会引起动物体内肌肉过度生长,导致动物出现双肌(double muscle,DBM)表型。自然突变的MSTN基因已经在牛、绵羊、山羊、马、猪、狗、兔等动物中发现,通过基因编辑技术同样在许多物种中实现了MSTN基因的人工诱变。在现代家畜育种中,
城市污水再生、水资源可持续循环利用已成为全球许多国家和地区解决水资源短缺和水环境污染问题的重要策略。以城市二级出水、雨洪水及其他地表水体为源水,再生回灌至地下含水层中,是全球倍受关注的水资源高效循环利用新途径,也是我国国务院《水污染防治行动计划》及《节水型社会建设“十三五”规划》等国家战略积极推动的议题。研究这一过程水质安全风险与关键控制技术是这一领域的核心科学问题。由于再生水源水的多样性、地区差