本论文主要研究奶水牛活体采卵——体外受精技术、超数排卵技术、同期发情技术、胚胎移植技术和B超诊断技术等新技术,目的是建立奶水牛体外和体内胚胎生产技术体系,研究建立一套适合奶水牛体外和体内胚胎生产程序;研究完善高效的水牛同期发情技术和胚胎移植技术体系,提升奶水牛体外和体内胚胎生产技术水平,提高水牛繁殖效率,促进水牛奶业的发展。论文分两部分:第一部分为文献综述,包括第一章;第二部分是试验研究,包括第二、第三、第四和第五章。　　 第二章探讨影响水牛活体采卵的主要因素,逐步建立以体外受精技术为基础的体外胚胎生产技术体系。第一节主要通过对不同负压、不同品种、不同年龄、不同采卵频率、不同繁殖季节、激素处理与未用激素处理供体牛以及怀孕牛与空怀牛等因素进行研究,结果表明:(1)不同压力对A、B、C、D级卵母细胞回收以及头均可用卵母细胞回收数均有显著差异(P＜0.05),其中40-50mmHg和50-70mmHg可显著增加A、B级卵母细胞百分率,尤其是40-50mmHg的压力对增加A级卵母细胞效果显著。但压力对卵母细胞回收率没有显著差异(P:0.273)。综合上述分析,40-50mmHg的压力较为适宜水牛的活体采卵。(2)尼里/拉菲水牛和三品杂水牛每头均可用卵母细胞分别是3.30±0.13、3.16±0.12枚,而摩拉水牛是2.65±0.10枚,尼里水牛和三品杂与摩拉水牛差异显著(P＜0.05),而尼里和三品杂之间,差异不显著。就回收卵母细胞总数而言,尼里水牛和三品杂与摩拉水牛差异显著差异极显著水平(P＜0.05)。(3)各品种对优质卵母细胞率差异不显著。连续活体采卵时,各批次的优质卵母细胞的百分率、回收率没有显著差异(P＞0.05)。但各批次之间,C级卵母细胞变化是差异极显著的(P＜0.0001),随着活采次数增加,C级卵母细胞(裸卵和网状细胞)所占的比例不断减少。(4)不同年龄阶段的水牛供体,只有优质卵母细胞回收率达差异极显著水平(P＜0.0001),也就是青年组供体水牛获优质卵母细胞效果最好,达66.40％,中年组次之,是62.13％,老年组只有54.40％,因此年龄越大,获优质卵母细胞率越差。(5)繁殖季节与非繁殖季节每头均获卵母细胞数(4.36vs4.22枚)、每头均可用卵母细胞数(3.0vs2.99枚)和回收卵母细胞可用率(63.75％vs65.07％)差异不显著,也就是说季节对活采没有显著的影响。(6)在非繁殖季节,用FSH处理与未用激素处理对水牛卵细胞回收总数、可用卵母细胞总数和优质卵母细胞率没有显著的影响(P＞0.05)。(7)对怀孕水牛和空怀水牛进行OPU,每头均获卵母细胞总数、可用卵母细胞数、可用卵母细胞率在不同生理状况是差异不显著的(P＞0.05),这表明怀孕的供体水牛也可进行活体采卵,能提供可用卵母细胞。　　 第二节探讨不同活采批次和不同水牛品种活采对体外受精效果;比较活体采集卵母细胞与离体采集卵母细胞IVF生产胚胎效果;探讨外源激素处理供体奶水牛采集卵母细胞的IVF效果;探讨在成熟培养液中添加不同卵泡液提高水牛的IVF效果,进一步完善体外胚胎生产技术体系。研究结果表明:(1)对供体水牛连续进行5次活体采集卵母细胞进行IVF,第1次采卵回收的卵母细胞体外受精分裂率明显低于第2、3、4、5次,分别为45.32％、59.91％、62.62％、59.42％和55.83％;而各批次活体采集的卵母细胞经体外受精后囊胚率分别为19.06％、21.84％、28.16％、24.64％和21.17％,差异不显著(P＞0.05)。(2)摩拉水牛、尼里/拉菲水牛、三品杂交水牛活体采集的卵母细胞体外受精后囊胚率分别为23.03％、21.12％和18.22％,差异也不显著(P＞0.05)。(3)在非繁殖季节,在采卵前用FSH处理供体水牛后采集卵母细胞,其IVF的卵裂率、囊胚率分别是69.13％、39.97％。而无激素处理的对照组的卵裂率和囊胚率分别是59.48％、21.58％,但两组间的卵裂率、囊胚率差异不显著(P＞0.05)。该结果表明进行活体采卵前用FSH处理供体水牛,并没有显著的影响活采效果。(4)活体采集卵母细胞进行IVF生产胚胎,其卵裂率(67.38％)比屠宰场的卵母细胞卵裂率(57.15％)高,差异显著(P＜0.05);其囊胚率(38.04％)也比屠宰场的囊胚率(25.67％)要高,差异极显著(P＜0.001)。(5)添加BuFF对活体采集卵母细胞和屠宰场收集卵母细胞的体外受精卵分裂率没有差异(P＞0.05),但添加5％和10％BuFF对卵母细胞体外受精后的胚胎发育有明显促进作用,囊胚率均明显高于对照组和15％BUFF组(P＜0.01),5％和10％BuFF组间没有差异(P＞0.05);添加15％BUFF囊胚率有降低的趋势,但与对照组差异不显著(P＞0.05)。而添加10％BoFF对活体采集卵母细胞体外受精的受精卵分裂率和囊胚率均明显高于对照组和5％BoFF组(P＜0.01),添加5％BoFF的受精卵分裂率和囊胚率与对照组没有差异(P＞0.05);添加BoFF对屠宰场收集水牛卵母细胞体外受精卵分裂率没有差异(P＞0.05),但添加5％和10％BoFF的囊胚率均明显高于对照组(P＜0.05)和15％组(P＜0.01),添加15％BoFF与对照组比较,囊胚率降低明显(P＜0.05),5％和10％BoFF组间囊胚率没有差异(P＞0.05)。因此,在水牛卵母细胞成熟培养液中添加5-10％的BLIFF或BoFF代替牛血清,可明显提高水牛体外胚胎生产效率,且以添加同种的BuFF效果略好。　　 第三章主要研究奶水牛体内胚胎技术,分两个试验。试验一应用不同的FSH及PGc、LHRH-A3、LH等激素评价奶水牛超数排卵效果,分6种组合方式对35头河流型奶水牛进行超数排卵对比试验。Ⅰ组:日本FSH(26单位)+上海PGc(0.6mg);Ⅱ组:日本FSH(26单位)+上海PGc(0.6rng)+宁波LHRH-A3(50μg);Ⅲ组:北京FSH(20mg)+上海PGc(0.6mg)+宁波LHRH-A3(50μg);Ⅳ组:北京FSH(20mg)+上海PGc(0.6mg)+宁波LH(50μg);Ⅴ组:加拿大FSH(800mg)+上海PGc(0.6rag);Ⅵ组:加拿大FSH(800mg)+上海PGc(0.6mg)+宁波L,HRH-A3(50μg)。结果表明:超排有效率为97.14％(34/35),每头均有成熟卵泡8.711个(296/34),每头均黄体数5个(170/34),平均排卵率57.43％(170/296),每头均获取胚胎数2.72枚(49/18),每头均获可用胚胎数1.33枚(24/18),回收率39.84％(49/123),可用率48.98％(24/49)。Ⅱ组每头均黄体数最高(6.86±5.96个),V1组排卵率最高(76.92％),使用LHRH-A3处理比不用促排组排卵率高12.12％,比使用LH组排卵率高28.62％。　　 试验二为了探讨免疫抑制素对奶水牛超数排卵的作用,为进一步揭示水牛超排机理和提高水牛超排效果提供理论依据。选取17头具有正常发情周期的母水牛,随机分为实验组10头,对照组7头,实验组首次免疫重组猪抑制素亚基融合蛋白1mg/头,首免后第28和第56天分别进行加强免疫,剂量为0.5mg/头,对照组牛同期注射矿物油与生理盐水混合佐剂,实验组牛在首免当天、首免后第28(二免)和第56天(三免)分别用B超仪进行卵泡大小监测和计数,在超排后第六天用B超仪进行卵泡和黄体数进行统计。用免疫抑制素组水牛平均卵泡数在加强免疫后,卵泡数量增加(从8.8增加到15.0个),与对照组相比,但差异不显著(P＞0.05)。超排后,实验组的平均成熟卵泡数、黄体数和排卵率分别是12.2±0.79,9.0±1.06,73.77％,与对照组相比,差异显著。胚胎回收总数和可用胚胎数差异不显著。实验结果表明,利用免疫抑制素免疫水牛,可提高水牛的超排效果。　　 第四章主要研究水牛同期发情处理和胚胎移植技术,分两个试验。试验一的目的是通过对不同的水牛品种、不同药物处理、不同给药方式、不同季节以及自然发情和同期发情对配种后受胎效果进行了系统研究,以期建立一套稳定的适合水牛同期发情的处理方法。试验选取本地水牛(102头)、摩拉水牛(129头)、尼里/拉菲水牛(98头)和杂交水牛(326头)共655头,分为5个组进行比较试验。结果表明:河流型摩拉水牛和尼里/拉菲水牛的同期发情率和配种受胎率均高于杂交水牛和本地水牛(P＜0.05),但同为河流型的摩拉和尼里/拉菲水牛之间没有差异(P＞0.05),以本地水牛效果最差,其同期发情率和配种受胎率分别为74.51％和30.39％;应用不同的药物处理时,以GnRH+PGF2a+GnRH效果最好,同期发情率和受胎率分别为88.46％和46.38％,其同期发情率显著高于其它各药物组(P＜0.05),而用PGc的效果最差(分别为79.10％和33.21％);用PMSG肌注+PGc灌注法,其同期发情率和受胎率效果最好,显著高于其它各组(P＜0.05),其次是PMSG肌注+PGc肌注法,PGc肌注法效果最差;在冬季进行同期发情处理时,同期发情率和受胎率最高(分别为83.75％和43.28％),明显高于其它各季节(P＜0.05);水牛自然发情的人工授精受胎率和胚胎移植的受胎率均比同期发情的高,差异显著(P＜0.05)。　　 试验二主要探讨影响体细胞克隆胚胎移植的效率的因素。本研究从不同发情方式、不同胚胎类型、不同移植时间以及不同季节来探讨影响水牛体细胞克隆胚胎移植的效率。研究发现,移植第六天的新鲜或冷冻克隆胚胎的受体怀孕率是最高的,但移植不同阶段的新鲜或冷冻克隆胚胎的受体怀孕率没有显著性的差异(鲜胚P=0.2607,冻胚P=0.06527)。秋季移植克隆胚胎的受体怀孕率为最高,可达16.06％,显著性地高于其他季节移植的结果(P＜0.05),春季次之,夏季和冬季的移植的效果不好,差异也不显著(P＞0.05)。结果表明,秋季移植体细胞克隆胚胎可获得较高的怀孕率。　　 第五章利用B超诊断技术在水牛早期妊娠诊断、水牛胚胎移植受体牛检查以及卵泡动力学等方面进行研究,以探讨该技术在水牛生产与繁殖中的应用。第一节通过B超诊断检查不同阶段水牛怀孕的准确率进行研究。结果表明:B超妊娠诊断在20-25d、26-35d、36-45d3个时间段的诊断准确率分别是,65.27％、81.44％、100％,各阶段的诊断准确率差异显著。因此利用中等性能B超进行早期妊娠诊断的最佳时间段为36-45d。第二节对水牛不同发情阶段的卵泡、黄体和卵巢疾病进行了实时超声和动态跟踪。第三节使用B-型超声波跟踪观察了12头河流型水牛、杂交水牛、沼泽型水牛的发情周期在不同繁殖季节地卵泡发育情况,结果表明:(1)不同水牛的品种在不同繁殖季节,他们的发情周期是不同的。(2)无论是在繁殖还是非繁殖季节,二波周期卵泡波出现的时间在各品种之间没有显著差异。(3)沼泽型水牛、杂交水牛与河流型水牛第1波征集的卵泡数在繁殖和非繁殖季节征集卵泡数差异显著(P＜0.05),而沼泽型水牛和杂交水牛在繁殖和非繁殖季节差异不显著。沼泽型水牛、杂交水牛与河流型水牛第2波征集的卵泡数在繁殖和非繁殖季节征集卵泡数差异显著(P＜0.05),而沼泽型水牛和杂交水牛在繁殖和非繁殖季节差异不显著。(4)各品种在繁殖和非繁殖季节,第1波优势卵泡出现时间差异不显著(P＞O.05)。在繁殖季节,沼泽型水牛第2波出现优势卵泡时间与河流型水牛和杂交水牛优势卵泡出现时间差异显著(P＜0.05)。