翻译后修饰指的是修饰基团添加到翻译后蛋白质的一个或者多个氨基酸残基上,可改变该蛋白的空间构象和生物学活性。翻译后修饰广泛参与调控细胞周期、增殖、凋亡、分化基因表达、信号传递等一系列生命活动,异常的翻译后修饰与疾病和肿瘤的发生密切相关。组蛋白泛素化是共价翻译后修饰之一,泛素化修饰过程通常由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3共同调节完成整个泛素级联反应。真核细胞中,染色质是由基因组DNA缠绕核小体构成的,核小体的核心部分是由组蛋白H2A,H2B,H3和H4各2个分子构成的蛋白8聚体。RNF20/RNF40二聚体(RING finger protein RNF20/RNF40 dimer)是催化人H2B组蛋白120位赖氨酸(lysine)单泛素化(H2Bub1)反应的E3泛素连接酶。H2Bub1介导基因转录调控,染色质重塑,并在DNA双链断裂损伤修复途径之一的同源重组修复(Homologous Recombination,HR)中发挥重要的作用。RNF20/RNF40二聚体的缺失会导致同源重组修复中修复因子不能募集到DNA损伤位点上,导致DNA双链断裂损伤的累积并影响基因组的稳定。另外,有研究表明RNF20/RNF40二聚体敲除的细胞中出现R-loop的累积的现象,是导致复制压力和基因组不稳定性的原因之一。R-loop是在转录过程中由RNA聚合酶Ⅱ(RNA PolⅡ)参与形成的DNA:RNA杂合体,由一条新生的RNA链与其模板DNA构成的三链核酸结构。R-loop产生原因包括DNA序列中GC含量偏高,拓扑异构酶缺失,RNA合成受损等。在RNF20/RNF40二聚体敲除的细胞中,与RNA加工和剪接相关的基因被上调,是R-loop的累积的标志之一。sc35是丝氨酸精氨酸蛋白剪接因子(也称为SRSF2),在m RNA剪接和RNA代谢中发挥很重要的作用。研究表明,sc35在维持基因组稳定性中也起到了重要的作用,因为sc35缺失与RNF20/RNF40二聚体缺失会产生相似的现象,即sc35的缺失也会导致R-loop的富集和DNA双链断裂损伤的累积。许多因子类似于染色质重塑因子和RNA加工因子等会抑制R-loop的形成。比如说,除sc35抑制R-loop外,R-loop也会被一些酶降解,RNases H1和H2可以降解R-loop中的RNA链,RNA-DNA解旋酶可以解旋DNA:RNA杂合链,例如senataxin(SETX)和aquarius(AQR)。RNase或RNA解旋酶的缺失和突变会通过R-loop的积累加剧DNA损伤并导致染色质不稳定性增加,进而诱发各类疾病的产生。根据以前的研究我们知道RNF20/RNF40二聚体的缺失会减少H2Bub1,从而导致组蛋白m RNA加工缺陷及R-loop富集。同样,sc35的缺失也促进了R-loop的形成。此外,WAC是RNF20/RNF40二聚体的一个重要功能蛋白,WAC的C末端的coiled-coil结构域与RNF20/RNF40二聚体结合,构成RNF20/RNF40/WAC复合物共同参与到H2Bub1中去。因此,本课题主要的目的是探究WAC与sc35在基因转录,调节R-loop及DNA损伤修复中是否发挥协同作用。首先,我们通过内源性的免疫共沉淀实验(内源性Co-IP实验)证明WAC与sc35这两种蛋白有相互作用。其次,通过染色质免疫共沉淀技术(Ch IP-q PCR)检测蛋白质在不同基因上的富集情况,实验证明WAC,sc35和RNF20三种蛋白质在p21,PUMA,IκBα三种基因上相同的富集程度,说明WAC和sc35在p21,PUMA,IκBα等基因的转录过程中有协同作用。接下来,通过RNA/DNA Hybrid IP实验验证了WAC和sc35参与到R-loop中,S9.6(识别R-Loop的抗体)与WAC,sc35和RNA PolⅡ有相互作用。我们知道,R-loop与DNA复制叉的碰撞会导致DNA双链断裂损伤,我们已证明WAC与sc35共同调节R-loop,接下来我们研究了WAC与sc35介导的R-loop如何参与到DNA损伤修复中去。ATM/ATR激酶是DNA损伤和复制应激反应的主调节因子,ATR通路被激活会导致下游Chk1磷酸化,ATM通路被激活会导致下游Chk2磷酸化,这两条通路都会进一步激活下游基因从而达到保护基因组的目的。我们运用si RNA技术分别敲低WAC,sc35,RNF20和SETX,通过Western-Blot实验发现Chk1蛋白表达量有明显的升高,说明ATR-Chk1通路被激活。总的来说,WAC与sc35在基因转录,调节R-loop及DNA损伤修复中发挥协同作用。