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金针菇(Flammulina velutipes)是一种低温型食用菌,其原基的形成和子实体的发育需要经过10~13℃的低温刺激。冷诱导金针菇原基形成过程受到一些功能基因的调控,找到并研究这些相关基因的调控机理具有重要的意义。组氨酸激酶基因和GATA Zinc finger转录因子在冷诱导金针菇原基形成过程中起着至关重要的作用。组氨酸激酶是双组分系统的一种,当植物受到低温刺激时,自身能够启动感受低温信号和将信号传导出去的信号通路,将外界的低温信号传递到细胞内,并诱导相应基因的表达。GATA Zinc finger是一类重要的转录因子,其普遍具有锌指结构,在植物的生长发育和冷诱导机制的信号传导途径中起着重要的调控作用。CRISPR/Cas9系统是近几年发展起来的一种新型基因编辑技术,目前被广泛的运用到多种生物中进行基因改造。CRISPR/Cas9系统只需要一个具有核酸酶功能的Cas9蛋白,和一个具有识别及定位功能的sgRNA就可以发挥基因编辑作用。本研究首先通过生物信息学分析得到差异表达基因,构建带有目标基因的CRISPR/Cas9表达系统,采用PEG介导原生质体的方法,首次将构建的带有组氨酸激酶基因和GATA转录因子的CRISPR/Cas9表达载体共转入金针菇原生质体,利用CRISPR/Cas9系统的基因编辑功能,对金针菇中的组氨酸激酶基因和转录因子进行敲除,以此来验证这些基因的功能。主要研究结果如下:(1)通过转录组测序,得到了7935个差异表达基因,再通过比较转录组学和生物信息学分析,找到与冷诱导和生长发育相关的差异基因,在原基阶段表达量下调的两个组氨酸激酶基因HK1和HK2和一个GATA Zinc finger转录因子。(2)利用sgRNA在线设计工具以及sgRNA靶点的设计原则,针对两个组氨酸激酶基因和一个GATA Zinc finger转录因子的基因序列,分别设计了一个sgRNA,靶序列分别为GATGGACAGCGGAAAATTGG、GTACCTGTTCGAATGAATGA和GTGGCCAAGCACTTGGAACA。(3)采用酶切连接法和重叠延伸PCR的方法,构建了6个表达载体,分别是:pgfvs-Cas9、pHK1-gRNA、pHK2-gRNA、pZf-gRNA、pgfvs-Cas9-HK1-gRNA和pgfvs-Cas9-HK2-gRNA。(4)通过金针菇原生质体单核化,得到了3个单核菌株:D-A、D-C和D-D,通过对单核菌株出菇实验,得到单核菌株均能出菇,最终确定了转化所需的单核菌株为:D-C。通过潮霉素的抗性筛选,确定了金针菇菌丝体及原生质体对潮霉素的最低敏感浓度均为50μg/mL。(5)采用PEG介导的方法,将CRISPR/Cas9表达载体共转化金针菇原生质体,经过潮霉素初步筛选,PCR的鉴定后,总共有8个携带有HK1基因的载体的Cas9蛋白基因整合到了金针菇的基因组中,总共有4个携带HK2基因的载体的Cas9蛋白整合到了金针菇的基因组中。