施氏鲟卵中雌性蛋白的纯化、鉴定及检测

来源 :上海水产大学 上海海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ylycxr
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雌性蛋白,又称雌性特异蛋白,特异地位于某些雌性卵生动物的体内,其主要存在于动物的组织、器官及血液中。它可共价结合糖和磷,非共价结合脂,是一种含脂、磷的大分子蛋白,目前研究较多的雌性蛋白主要是卵黄蛋白原。卵黄蛋白原作为卵黄蛋白的前体物质,通常是在激素诱导下由肝脏合成,然后通过循环系统进入卵巢,被正在生长的卵母细胞通过内吞作用吸收,并将其降解为卵黄蛋白,它可参与形成卵黄,进而为未来胚胎的发育提供营养和能量需求。鱼类的卵黄蛋白纯化、鉴定方面研究已有大量的文献资料,而有关施氏鲟卵黄蛋白的纯化、鉴定及检测方面还尚未见报道。作为黑龙江的特有品种,施氏鲟越来越受到人们的关注,随着其养殖规模的日渐扩大和养殖利润空间的日益缩小,人们将目光更多的投向鲟鱼的全雌化生产,而施氏鲟雌性特异蛋白的纯化、检测方面的研究,便可为这方面提供更多的帮助与支持。 本文以施氏鲟卵巢卵为实验材料,用Sephadex G-100凝胶过滤柱和DEAE Sephadex.A25离子交换柱首次纯化得到施氏鲟一种雌性特异的卵黄蛋白,并对其理化性质进行了研究。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)只显示一条蛋白带,说明纯化所得的物质就是施氏鲟的卵黄蛋白,而变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)则出现两条蛋白带,这表明该施氏鲟卵黄蛋白有两个蛋白亚基,其分子量分别为109KDa和98 KDa。将天然电泳后的凝胶分别利用油红O进行脂蛋白特异性染色和罗丹明B进行磷蛋白特异性染色,结果显示凝胶与这两种试剂均出现阳性反应,从而说明该施氏鲟卵黄蛋白是一种富含脂、磷的大分子蛋白。 用纯化得到的施氏鲟卵黄蛋白与佐剂混匀后注射到新西兰大白兔体内来制备多克隆抗体,利用免疫双扩散的方法测得其抗血清效价为1:16。将所得的抗血清用硫酸氨分步盐析法进行纯化浓缩,通过 Western blotting方法来检测所得抗体的特异性,结果表明施氏鲟卵黄蛋白的抗体具有较好的特异性,可用于下面的实验研究。通过免疫双扩散还发现,在通常条件下卵黄蛋白具有明显的性别特异性和种特异性。 取4龄施氏鲟雌鱼的肝脏、肠、性腺及血液,分别制成石蜡切片和血涂片,然后运用免疫组织化学的方法来检测施氏鲟体内卵黄蛋白的代谢途径,进而为施氏鲟的全雌化生产提供帮助。结果显示施氏鲟卵黄蛋白只存在于肝脏和血液中,而在肠道和性腺则没有发现卵黄蛋白的存在,从而说明施氏鲟体内卵黄蛋白的代谢途径存在外源性这种方式。在这种途径的代谢过程中,卵黄蛋白的前体物质一卵黄蛋白原首先在肝脏中大量合成,然后通过血液循环运输到卵巢,在那里被卵母细胞通过胞饮作用吸收,最终裂解为卵黄蛋白,进而作为卵母细胞的主要蛋白成分和胚胎发育的重要营养和能量来源。
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