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研究背景阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）是人类最常见的痴呆类型之一,它可以引起进行性的记忆损害、认知功能下降和行为异常。伴随着人口老龄化,AD日益成为威胁人类健康的主要疾病之一。迄今为止,AD仍然缺乏的有效预防与治疗手段。临床流行病学资料提示,伴随着衰老过程,年龄相关性的血清雄激素水平下降与AD的发病率呈现正相关性变化。补充雄激素可以明显降低AD的发病风险。越来越多的资料提示,双氢睾酮（Dihydrotestosterone, DHT）在AD的预防与治疗中具有广泛的神经生物学作用,有助于抑制AD病理损伤,修复损伤的神经元与突触可塑性修复等神经保护效应。因此,雄激素作为预防与治疗AD的潜在药物越来越多引起国内外的广泛关注。进一步阐明雄激素的神经保护作用及其分子作用机制,可能为我们探索预防与治疗AD的新方法提供非常重要的理论与临床依据。研究目的为了进一步阐明雄激素的神经保护作用及PI-3K/Akt信号通路在其神经保护作用中的潜在作用。本研究采用C6细胞作为体外神经胶质细胞研究模型,利用Aβ25-35诱发C6细胞凋亡活动,观察双氢睾酮（DHT）对Aβ25-35诱发C6细胞凋亡活动的影响,并探讨其可能的神经保护作用分子机制。研究方法第一部分通过雄激素受体（AR）间接免疫荧光染色,在倒置荧光显微镜及激光共聚焦显微镜下观察C6细胞上AR的表达情况。第二部分对C6细胞使用不同浓度和不同时间梯度的DHT处理后,利用Western Blotting检测法观察DHT对C6细胞Akt激酶磷酸化激活的效应；并进一步加用PI-3K抑制剂LY294002研究其对DHT磷酸化激活C6细胞上Akt激酶表达的影响。第三部分利用不同浓度的梯度Aβ25-35处理培养的C6细胞后,通过AnnexinV--FITC/PI双染流式细胞术定量观察Aβ25-35诱导的C6细胞发生凋亡活动的情况；加用DHT后,通过流式细胞术和Hochest33342染核分别定量和定性检测观察DHT抗Aβ25-35诱导的C6细胞凋亡活动的影响；利用PI-3K抑制剂（LY294002）处理C6细胞后,通过AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术,进一步观察PI-3K/Akt信号通路在DHT抗Aβ25-35诱导的C6细胞凋亡活动的作用。第四部分DHT和Aβ25-35干预C6细胞后,通过WB检测法分别观察DHT和Aβ25-35对C6细胞凋亡蛋白相关蛋白Seladin-1、Bax、Bcl-x1表达的调控作用,进一步阐明DHT抗Aβ25-35诱导C6细胞发生凋亡活动保护作用的潜在分子机制。研究结果第一部分在倒置荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察后发现,间接免疫荧光染色后的雄激素受体（AR）在离体培养的C6细胞上存在广泛、高水平表达,细胞膜、胞浆上均有明显表达。上述实验结果提示,培养的C6细胞存在高水平的膜AR、胞浆AR表达。第二部分Western Blotting检测发现,C6细胞在不同浓度(10-3μM-100μM)的DHT作用下,均能明显促进C6细胞Akt激酶磷酸化（P<0.05）,在10-1μM浓度时磷酸化激活效应最明显；我们利用10-1μM浓度的DHT进一步处理C6细胞发现,DHT对C6细胞的Akt磷酸化激活存在明显的时间梯度变化,孵育30分钟后即发现明显的Akt磷酸化激活,而在1小时时作用最明显（P<0.05）。此外,我们进一步观察了PI-3K抑制剂LY294002对DHT诱导的C6细胞Akt激酶磷酸化激活的影响,Western Blotting检测发现,PI-3K抑制剂LY294002可以抑制DHT诱导的Akt激酶磷酸化激活作用（P<0.05）,而在50μM浓度时能产生明显抑制效应,上述结果提示,DHT通过AR受体介导激活C6细胞的PI-3K/Akt信号通路。第三部分通过AnnexinV--FITC/PI凋亡双染流式细胞术检测发现,不同浓度（6.75μM、12.5μM、25μM和50μM）的Aβ25-35处理C6细胞24小时后均可以明显诱导C6细胞发生凋亡活动,早期凋亡率平均值和标准差分别为：0.497±0.028、0.685±0.192、4±0.442和5.58±1.2；总凋亡率的平均值和标准差分别为3.367±0.028、3.693±0.008、8.05±0.442和10.263±1.201。经统计分析得出均有统计学意义（P<0.05）,并且Aβ25-35在浓度为25μm时诱导发生凋亡活动最具意义,此时如再增加Aβ25-35的浓度并不能引起更具统计学差异的凋亡活动发生；而凋亡流式细胞术检测发现DHT对Aβ25-35诱导的C6细胞凋亡有明显的抑制作用,统计学分析这种凋亡抑制作用具有统计学差异（P<0.05）,同时利用Hochest33342染核荧光纤维镜观察C6细胞经Aβ25-35处理后出现细胞变形、细胞核皱缩向核膜周边聚集、细胞核碎裂等典型凋亡现象,而在Aβ25-35处理前加用DHT后观察C6凋亡现象明显下降。进一步凋亡双染流式细胞术检测发现PI-3K抑制剂LY294002可以明显抑制DHT的这种凋亡抑制作用（P<0.05）。上述实验结果提示,DHT通过PI-3K/Akt信号通路产生抗Aβ25-35诱导的C6细胞凋亡的神经保护作用。第四部分C6细胞经过DHT、Aβ25.35孵育处理后,WB检测发现,Aβ25-35明显下调凋亡保护蛋白Seladin-1、Bcl-xl表达,而促凋亡蛋白Bax表达显著上调；进一步观察发现,DHT可以明显促进C6细胞凋亡保护蛋白Seladin-1、Bcl-xl表达上调,而促凋亡蛋白Bax表达显著下调,DHT明显抑制了Aβ25-35诱导的凋亡相关蛋白Seladin-1、Bcl-xl下调表达和Bax蛋白的上调表达作用。上述实验结果提示,Aβ25-35通过调控C6细胞凋亡相关蛋白Seladin-1、Bcl-xl和Bax蛋白表达而产生诱导凋亡效应,而DHT可能通过抑制Aβ25-35诱导的凋亡相关蛋白表达效应而产生抗Aβ25-35诱导C6细胞凋亡的保护作用。研究结论根据上述实验结果,在C6细胞模型上,我们发现Aβ25-35可以明显诱导体外培养的C6细胞发生凋亡活动,而DHT具有明显的抗Aβ25-35诱导的C6细胞凋亡作用,PI3K抑制剂LY294002可以明显阻断DHT抗细胞凋亡保护作用。因此,我们推测DHT可能通过激活PI3K-Akt信号通路参与抗Aβ25-35诱导C6凋亡作用；其分子作用机制可能是通过激活PI3K-Akt信号通路介导凋亡保护蛋白Seladin-1、Bcl-xl蛋白表达上调和促凋亡蛋白Bax蛋白表达下调而发挥抗凋亡保护效应。