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目的:检测丁香活性组分（The active fraction from clove,AFC）对人结肠癌HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO细胞增殖的抑制作用,筛选出抑制作用最明显的HCT116细胞株;探讨丁香活性组分诱导HCT116细胞产生自噬与凋亡,并通过联合自噬特异性抑制剂巴弗洛霉素A1（Baflomycin A1）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）阐明其诱导的凋亡与自噬之间的相互关系;研究丁香活性组分对人结肠癌细胞PI3K/Akt/m-TOR信号通路的影响,揭示丁香活性组分诱导人结肠癌细胞自噬与凋亡的分子机制。方法:1、细胞培养:HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO细胞株复苏后,分别用McCoy’s 5A、RPMI1640、RPMI1640、DMEM高糖、F12培养基+10%胎牛血清+1%青霉素链霉素液,于37℃、5%CO2条件下孵箱中培养。2、细胞活力检测:（1）AFC（25、50、100、200、400μg/ml）处理各肿瘤细胞48h,CCK8法检测各肿瘤细胞的细胞增殖能力变化。（2）AFC（25、50、100μg/ml）处理HCT116细胞24、48、72h,CCK8法检测AFC对HCT116细胞细胞增殖能力的时间浓度依赖性影响。3、细胞凋亡检测:AFC（25、50、100μg/ml）作用于HCT116细胞48 h后,采用Hoechst 33258荧光染色、流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法检测AFC对HCT116细胞凋亡的影响;采用Western Blot检测凋亡相关蛋Caspase-3、Caspase-9、PARP的表达。4、细胞自噬检测:（1）GFP-LC3转染:Ad-mCherry-GFP-LC3B重组腺病毒转染HCT116细胞24h,加入AFC 100μg/ml继续培养48h,4%多聚甲醛固定,荧光显微镜下拍照并计数自噬斑点的数目来检测自噬水平的强弱。（2）透射电子显微镜观察:胰酶收集细胞,以2.5%的戊二醛溶液、1%四氧化锇溶液固定后,采用梯度乙醇溶液脱水,环氧树脂812包埋细胞,制成超薄切片。醋酸双氧铀和醋酸铅染色后在透射电镜观察自噬体和自噬溶酶体的形成。（3）AFC（25、50、100μg/ml）处理HCT116细胞12、24、48 h后采用Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达。5、AFC诱导的细胞凋亡与自噬的相互关系:取对数生长期的HCT116细胞,将细胞分为6个组:Control组（用不含干预药物的McCoy’s 5A完全培养基培养）;3-MA组（2mmol/L）;BA组（Baflomycin A1 1nM）;AFC组（100μg/ml）;AFC+BA组（1nmol/L Baflomycin A1+100μg/mlAFC）;AFC+3-MA组（2mmol/L 3-MA+100μg/mlAFC）。应用CCK8法检测各组细胞增殖能力,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,应用Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达,检测凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP的表达。6、PI3K/Akt/mTOR信号通路活性检测:（1）AFC（25、50、100μg/ml）处理HCT116细胞48 h,Western Blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路PI3K,p-PI3K,Akt,p-Akt,mTOR和p-mTOR蛋白表达情况。（2）取对数生长期的HCT116细胞,将细胞分为4个组:Control组,AFC100μg/ml组,特异性的PI3K抑制剂LY294002组（10μmol/L LY294002）,AFC+LY294002组（10μmol/L LY294002+100μg/ml AFC）。Western Blot检测Akt,p-Akt,mTOR和p-mTOR蛋白表达水平。结果:1、CCK8结果显示,AFC对HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO的半数抑制浓度分别是120.4±4μg/ml、174±10μg/ml、212.6±19μg/ml、232.6±27μg/ml、280.5±13μg/ml,抑制作用最明显的是人结肠癌细胞HCT116。AFC（25-100μg/ml）作用HCT116细胞24h,CCK8结果显示并未对细胞产生很明显的抑制效果;作用HCT116细胞48h,25、50、100μg/ml AFC分别能抑制细胞活力至84%±9.39%、79.31%±6.14%、69.81%±5.35%;作用HCT116细胞72h,25、50、100μg/mlAFC分别能抑制细胞活力至81.03%±7.2%、74.33%±7.51%、61.43%±4.32%;50、100μg/mlAFC组在48、72h与对照组比较,差异具有统计学意义（P值均<0.01）。2、Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察到对照组细胞成弥散均匀的淡蓝色弱荧光,细胞形态趋于一致。25、50、100μg/ml AFC处理细胞后,均能观察到典型的细胞凋亡特征,如核染色质浓缩、核碎裂、凋亡小体的出现等,且各组凋亡形态学改变的程度与AFC作用的浓度呈正相关。AnnexinV-FITC/PI双染法检测显示,25、50、100μg/ml的AFC诱导HCT116细胞率分别为8.35%±0.61%、17.68%±1.19%、26.95%±1.75%,50、100μg/ml组与对照组比较,差异有统计学意义,（P值均<0.001）;Western Blot结果显示,Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP均被AFC以浓度依赖方式激活。50、100μg/ml AFC组Cleaved Caspase-3/Procaspase-3、Cleaved PARP/PARP、Caspase-9/Actin与对照组比较,差异有统计学意义（P值均<0.01）。3、（1）GFP-LC3转染后荧光显微镜下观察到结果:对照组细胞mCherry-GFP-LC3B以弥散的黄色荧光形式存在于细胞质中,100μg/mlAFC组细胞出现明显自噬斑点,mCherry-GFP-LC3B聚集在自噬体膜上,以黄色斑点和红色斑点的形式表现出来。（2）100μg/ml AFC作用于HCT116细胞48h后,透射电镜观察到大量的自噬体和自噬溶酶体,而对照组则无明显变化。（3）Western Blot结果显示,AFC（25、50、100μg/ml）作用12、24、48h后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅱ、Beclin-1相对表达量均呈浓度依赖性的逐渐增高。50μg/ml、100μg/ml AFC组在12、24、48h时,LC3Ⅱ/LC3Ⅱ与对照组比较差异有统计学意义（P值均<0.05）;Beclin-1/Actin与对照组比较差异有统计学意义（P值均<0.01）。4、CCK8法结果显示,作用于HCT116细胞48h后,BA组、3-MA组、AFC组、AFC+3-MA组、AFC+BA组分别抑制细胞增值率为91.5%±7.09%、89.7%±9.01%、74.3%±5.13%、40.5%±2.51%、54.2%±4.04%。BA组、3-MA组与对照组比较,无显著差异;AFC组与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.001）;AFC+3-MA组、AFC+BA组与AFC组比较,差异有统计学意义（P值均<0.001）。AnnexinV/PI双染法检测显示,Control组、BA组、3-MA组、AFC组、AFC+3-MA组、AFC+BA组凋亡率分别为6.36%±0.31%、6.65%±0.40%、7.21%±0.69%、27.64%±1.74%、45.02%±1.85%、40.8%±1.79%。BA组、3-MA组与对照组比较,无显著差异;AFC组与对照组比较,差异有统计学意义,（P<0.001）;AFC+3-MA组、AFC+BA组与AFC组比较,差异有统计学意义（P值均<0.01）。Western Blot结果显示,与Control组比较,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在3-MA组、AFC+3-MA组中相对表达量明显减少,在AFC组、BA组、AFC+BA组中相对表达量明显增加;自噬相关蛋白Beclin-1在AFC组中相对表达量明显增加,在BA组、3-MA组、AFC+3-MA、AFC+BA组中相对表达量明显下降。Western Blot结果显示,与Control组比较,凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP在AFC组、AFC+3-MA、AFC+BA组中相对表达量显著上升,而在BA组、3-MA组中无明显变化。分析显示Cleaved Caspase-3/Procaspase-3、Cleaved PARP/PARP,BA组、3-MA组与Control组比较,无显著差异;AFC组与Control组比较,差异有统计学意义,（P<0.01）;AFC+3-MA组、AFC+BA组与AFC组比较,差异有统计学意义（P值均<0.001）。5、Western Blot结果显示,与Control组比较,p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相对表达量呈浓度依赖性的递减,而PI3K、Akt、m-TOR在各组间无明显变化。50、100μg/ml AFC组p-Akt/Akt、p-mTOR/m-TOR表达量与Control组比较,差异均有统计学意义（P值均<0.01）。Western Blot结果显示,LY294002（10μM）、AFC（100μg/ml）、AFC+LY294002作用HCT116细胞48h后,与Control组比较,p-Akt、p-mTOR蛋白相对表达量呈依次降低,而Akt、m-TOR在各组间无明显变化。AFC组与Control组比较,p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR差异有统计学意义（P值均<0.001）;AFC+LY294002组与AFC组比较,p-Akt/Akt差异有统计学意义（P<0.001）,p-mTOR/mTOR差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1、AFC对人结肠癌细胞HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO的增殖均有一定抑制作用,但作用明显的是HCT116细胞,呈现一定的时间、浓度依赖性。2、AFC浓度相关性的诱导人结肠癌HCT116细胞发生凋亡,凋亡发生的途径与线粒体依赖性的Caspase激活有关。3、AFC诱导人结肠癌HCT116细胞发生自噬,诱导自噬的作用呈现时间、浓度依赖性。4、AFC联合自噬抑制剂BA、3-MA能减弱AFC诱导的HCT116细胞自噬,而增强其诱导的凋亡的发生,说明AFC诱导的HCT116细胞自噬对细胞起到保护性的作用,提高细胞对AFC的抵抗能力。5、AFC单独用药或联合LY294002用药,均证实AFC能浓度相关性的抑制PI3K/Akt/m-TOR通路,这与AFC诱导的HCT116细胞凋亡和自噬密切相关。