【背景】酒精性肝损伤严重威胁酗酒人群的健康,已经成为世界范围内亟待解决的重要公共卫生问题。一般认为氧化应激、炎症、线粒体功能障碍、凋亡与乙醛毒性均与酒精性肝损伤的发病机制密切相关。研究发现过量的酒精摄入能够导致胰岛素信号受损,但是关于胰岛素信号对酒精性肝损伤影响的相关研究还非常匮乏。以往的文献表明,作为一种调节糖稳态的重要内分泌激素,胰岛素具有维持线粒体功能、抗凋亡、抗炎、抗氧化等作用。我们实验室最近的研究也证实胰岛素信号可以通过调控Nrf-2为核心的抗氧化酶调节氧化还原平衡。肝也是胰岛素作用的敏感靶器官之一。以上现象提示,胰岛素信号激活可能是机体拮抗酒精性肝损伤的重要内源性保护机制。胰岛素信号功能障碍的最典型表现是胰岛素抵抗,研究表明胰岛素抵抗能够导致包括肝脏在内的诸多组织或器官发生氧化还原调控异常。我们推测,胰岛素抵抗可能对酒精性肝损伤的发生和发展发挥了重要的促进作用。根据以上的研究进展和教研室的前期工作,我们提出的科学问题是:胰岛素信号激活对酒精性肝损伤的影响及分子机制是什么?胰岛素抵抗对酒精性肝损伤的影响及分子机制又是什么?回答上述问题无疑有助于阐明酒精性肝损伤中胰岛素信号的关键作用,同时为酒精性肝损伤发病机制的认识及其防治提供新的思路。在此基础上还能初步揭示不同胰岛素水平和敏感性人群饮酒危害存在差异性的原因,进而为特定人群(如1型糖尿病病人和2型糖尿病病人)进行针对性的酒精性肝损伤健康教育和防治提供理论与实验基础。【目的】1.研究胰岛素信号激活对酒精性肝损伤的影响及相关机制。2.研究胰岛素抵抗对酒精性肝损伤的影响及相关机制。3.探讨氧化应激、线粒体功能障碍、凋亡、炎症、脂代谢紊乱等相关病理因素在胰岛素信号对酒精性肝损伤影响中的改变。4.探讨以Nrf-2为核心的抗氧化防御系统功能、以CYP2E1为代表的酒精代谢酶、i NOS介导的NO生成、血清脂联素水平在胰岛素信号对酒精性肝损伤影响中的作用。【方法】1.胰岛素信号激活对酒精性肝损伤影响的体外实验:L02细胞先给予50n M胰岛素预处理4小时,间隔4小时后给予大剂量酒精刺激诱导肝细胞损伤。MTT检测细胞活力、试剂盒检测培养液上清AST/LDH活力、光镜观察细胞形态评价细胞损伤。Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测肝细胞凋亡、Western Blotting检测Bax/Bcl-2蛋白表达、试剂盒检测Caspase-3活力评价凋亡。采用Rhodamine 123检测MMP、Mito SOX检测线粒体ROS、试剂盒检测m PTP开放和ATP含量、Clark耗氧仪检测线粒体耗氧速率评价线粒体功能。采用DCFH-DA和DHE探针检测细胞内ROS水平、试剂盒检测MDA和GSSG评价氧化应激。试剂盒检测GSH含量、GSH/GSSG比值、SOD和GR活性、Western Blotting检测Nrf-2蛋白表达评价抗氧化防御系统。试剂盒检测CYP2E1活性,Western Blotting检测ADH、ALDH、CYP2E1蛋白表达,RT-PCR检测CYP2E1的m RNA表达评价酒精代谢酶改变。最后通过检测Akt和Erk的磷酸化水平和PI3K和Erk的抑制剂研究PI3K/Akt和Erk通路在其中的作用。2.胰岛素信号激活对酒精性肝损伤影响的体内实验:小鼠给予胰岛素腹腔注射激活胰岛素信号,4小时后给予大剂量酒精灌胃,每日两次,持续7天。实验结束后检测动物体重、肝重和血糖变化。H-E染色检测肝病理改变,试剂盒检测血清ALT/AST活力评价肝损伤。ELISA检测血清脂联素水平评价血清脂联素改变。试剂盒检测肝MPO活力,RT-PCR检测炎症因子TNF-α和IL-6的m RNA表达评价炎症反应。Western Blotting检测Bax/Bcl-2蛋白表达、试剂盒检测Caspase-3的活力评价凋亡改变。试剂盒检测肝匀浆ATP含量,新鲜分离线粒体并采用MTT检测线粒体活力和耗氧仪检测线粒体耗氧速率评价肝细胞线粒体功能。采用DHE探针检测肝冰冻切片ROS的水平,试剂盒检测肝匀浆中MDA、GSSG的含量,检测线粒体匀浆中GSSG的含量,Western Blotting检测i NOS蛋白表达及NO含量以评价肝脏氧化应激。检测肝匀浆GSH含量、GSH/GSSG比值,PRX-1、CAT、SOD-1、SOD-2、GR、GCLC、GPX-1及Nrf-2的蛋白表达或活性评价肝抗氧化防御系统的改变。RT-PCR检测CYP2E1的基因表达,同时检测CYP2E1、ADH、ALDH2的蛋白和活性水平评价酒精代谢相关酶的改变。最后通过检测肝甘油三酯水平和SREBP-1c的基因蛋白表达观察肝脂肪的改变。3.胰岛素信号功能障碍对酒精性肝损伤影响的体外实验:L02细胞先给予5μM地塞米松预处理24小时诱导胰岛素抵抗,通过检测胰岛素激活的Akt磷酸化和葡萄糖摄取鉴定胰岛素抵抗。我们观察了胰岛素抵抗对酒精诱导肝细胞活力损伤、凋亡、线粒体功能障碍和氧化应激的影响,同时检测了以Nrf-2为核心的抗氧化防御系统及CYP2E1的改变。主要实验方法与胰岛素信号激活体外实验(1)相一致。4.胰岛素信号功能障碍对酒精性肝损伤影响的体内实验:小鼠首先给予高脂饮食同时腹腔注射t BHP,持续30天,之后给予酒精暴露。通过空腹血糖和胰岛素检测、IPGTT和IPITT鉴定胰岛素抵抗。我们观察了胰岛素抵抗对酒精诱导肝损伤、凋亡、线粒体功能障碍、氧化应激和肝脂肪代谢紊乱的影响,同时检测了抗氧化防御系统、酒精代谢相关酶、i NOS介导的NO生成、血清脂联素水平的改变,主要实验方法与胰岛素信号激活体内实验(2)相一致。【结果】1.通过胰岛素预处理激活胰岛素信号能显著抑制酒精诱导的肝细胞活力损伤、凋亡、线粒体功能障碍和氧化应激。胰岛素预处理能提高以Nrf-2为核心的抗氧化防御系统功能,还显著抑制了酒精诱导的CYP2E1激活。PI3K和Erk的抑制剂能够在一定程度上抑制胰岛素对酒精性肝细胞的保护作用。2.通过胰岛素预处理激活胰岛素信号能抑制酒精导致的肝体比增加和空腹血糖降低,还减轻了酒精导致的肝损伤、炎症、凋亡、线粒体功能障碍和氧化应激。胰岛素预处理通过激活Nrf-2增强了抗氧化防御系统功能,同时还抑制了酒精诱导的肝组织CYP2E1和i NOS激活、血清脂联素水平降低。但胰岛素预处理也促进了酒精诱导的肝SREBP-1c激活和甘油三酯水平升高。3.地塞米松处理成功诱导L02细胞发生胰岛素抵抗,同时促进细胞ROS的生成。胰岛素抵抗促进了酒精诱导的肝细胞活力损伤、凋亡、线粒体功能障碍和氧化应激,同时发现胰岛素抵抗进一步降低了以Nrf-2为核心的抗氧化防御系统功能,还进一步促进了酒精诱导的肝CYP2E1激活。4.高脂饮食加t BHP处理成功诱导小鼠发生胰岛素抵抗。胰岛素抵抗促进了酒精诱导的体重减轻和肝体比增加,还促进了酒精诱导的肝损伤、炎症、凋亡、线粒体功能障碍和氧化应激。胰岛素抵抗通过抑制Nrf-2活化而减弱了抗氧化防御系统功能,同时还进一步促进了酒精诱导的肝组织CYP2E1和i NOS激活、血清脂联素水平下降。胰岛素抵抗进一步促进了酒精诱导的肝组织SREBP-1c激活和甘油三酯升高。【结论】1.胰岛素信号激活通过抗氧化、抗炎、抗凋亡、维持线粒体功能等途径对酒精诱导肝氧化损伤发挥保护作用,但胰岛素信号激活还能促进酒精导致的肝脂肪代谢紊乱。该结果提示,胰岛素信号激活既是机体拮抗酒精性肝氧化损伤的重要内源性保护机制,又是酒精脂肪肝发生的重要促进因素,具有“双刃剑”效应。2.胰岛素信号激活减轻酒精性肝氧化损伤的保护机制可能与以Nrf-2为核心的抗氧化防御系统功能增强、CYP2E1和i NOS抑制、血清脂联素水平升高密切相关。胰岛素信号激活促进酒精性脂肪肝的机制可能与SREBP-1c激活密切相关。3.胰岛素抵抗通过促氧化、促炎、促凋亡、促线粒体功能障碍等途径促进酒精性肝损伤,提示胰岛素信号功能障碍可能是酒精性肝损伤的重要危险因素。4.胰岛素抵抗促进酒精性肝损伤的机制可能与以Nrf-2为核心的抗氧化防御系统功能减弱、CYP2E1和i NOS激活、血清脂联素水平降低、SREBP-1c激活密切相关。