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黑色素瘤(melanoma)是死亡率极高的皮肤恶性肿瘤,在兽医临床上常见于老龄动物,在全球范围内发病率呈逐年上升趋势。其特点是恶性程度高、进展快、易远处转移,是一种对常规治疗药物具有较强的抗性,在临床治疗过程中颇为棘手的恶性肿瘤,对食品卫生和公共安全构成极大的危害。随着分子生物学、免疫学及相关学科的发展,基因治疗逐渐显示出巨大的优势,现已成为肿瘤治疗研究的热点。黑色素瘤作为一种浅表性肿瘤,非常适用于基因治疗的观察和研究。实体瘤中因存在局部免疫抑制、缺氧、血液供应不足、坏死区等,使肿瘤微环境中形成免疫逃逸现象,导致化疗药物无法顺利到达并发挥治疗作用,但却为一系列厌氧菌及兼性厌氧菌提供了有利的生长环境。这一发现预示某些细菌可能成为新型的肿瘤基因治疗载体。目前,影响肿瘤基因治疗效果的两大关键因素是治疗载体系统和治疗基因的选择。因此,寻找合适的靶向性载体和治疗基因是肿瘤基因治疗的核心,同时也是本课题的研究目的及科学意义所在。肿瘤靶向肽(RGD)是细胞外基质与细胞整合素αvβ3之间结合的强效竞争性拮抗剂,常被用作肿瘤靶向标记物。蜂毒肽(MEL)是蜂毒中具有药理作用和生物学活性的主要组分,在抑制肿瘤细胞转移和侵袭方面具有显著功效。为探索融合表达肿瘤靶向肽(RGD)和蜂毒肽(MEL)双基因重组减毒沙门氏菌对小鼠黑色素瘤的抑瘤作用,本试验构建了重组沙门氏菌LH430/pEGFP-RGD-MEL,通过侵染体外培养的小鼠黑色素瘤B16细胞,使目的基因在B16细胞中高效表达。通过CCK-8法、Western Blotting、扫描电镜以及流式细胞术等方法,检测重组减毒沙门氏菌对B16的细胞凋亡和抑制作用。CCK-8检测结果显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL对体外B16细胞的抑制率较高,且具有剂量和时间依赖性,其IC50值(6.02×10~5 CFU/μL)远低于HEK293细胞(5.39×10~7CFU/μL);Western Blotting检测结果显示,重组减毒沙门氏菌诱导B16细胞表达凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bcl2和Bax的量显著增多(p<0.05);扫描电镜下观察显示,B16细胞发生严重的形态学病变,出现较多突起,伪足消失;流式细胞术检测结果显示,重组减毒沙门氏菌可促进肿瘤细胞凋亡,B16细胞的存活率为24.7±5.81%。通过细胞划痕试验、Transwells法检测重组减毒沙门氏菌对B16细胞迁移、趋化和侵袭能力的影响。结果显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL可以抑制B16细胞的迁移,并可显著抑制FBS介导的细胞趋化能力(p<0.05),对B16细胞的侵袭能力也具有抑制作用,虽然与对照组之间没有表现出显著性差异(P=0.0507)。试验中成功建立了荷黑色素瘤小鼠动物模型,瘤内注射LH430/pEGFP-RGD-MEL(首次注射量1×10~5 CFU/只;二次注射量1×10~6 CFU/只)后,对荷瘤小鼠的体重和瘤体积进行阶段性测量,通过生物成像检测各器官报告基因的表达与分布状况,结果表明,肿瘤处荧光表达量高于其他组织。当肿瘤大小超过体重的5%时,处死小鼠,取肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑等组织,分别进行荧光蛋白表达检测、TUNEL染色、HE染色、免疫组化试验及Q-PCR检测。结果发现,LH430/pEGFP-RGD-MEL治疗组可以有效抑制小鼠肿瘤体积的增大,小鼠生存期显著延长,体重没有显著下降(p<0.05)。通过对各组小鼠肝脏、肾脏和肿瘤组织观察和重量测定结果显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL的抑瘤率高达90.84±8.11%,极显著高于RGD-MEL肽和MEL肽组;与LH430/pEGFP-MEL、LH430/pEGFP和顺铂组抑瘤率之间虽然没有差异显著性,但对小鼠内部器官的损伤明显低于这三个治疗组(p<0.01)。同时,经生物成像检测和Q-PCR检测结果显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL靶向性较好;经冰冻切片观察显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL治疗组小鼠肿瘤组织中外源荧光蛋白得到表达;组织HE染色结果发现,LH430/pEGFP-RGD-MEL治疗组小鼠肝脏、肾脏和肺等组织器官无明显的病变和肿瘤转移现象,肿瘤组织出现膜样结构,易剥离;免疫组织化学检测结果显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL治疗组肿瘤组织中Caspase-3、P53、GFP表达量显著增高;TUNEL染色结果显示,LH430/pEGFP-RGD-MEL治疗组小鼠肿瘤组织细胞凋亡率达48.31±1.26%,显著高于对照组(p<0.05)。为了探究重组减毒沙门氏菌治疗黑色素瘤的抑瘤机制,对瘤组织进行了RNA-seq研究。试验结果表明,LH430/pEGFP-RGD-MEL治疗组与PBS组相比,差异基因主要富集于机体免疫和肿瘤相关通路,通过破坏肿瘤组织中的免疫逃避,激活肿瘤组织内的T细胞免疫应答来发挥抑瘤作用。本试验成功构建了携带RGD-MEL双基因的减毒沙门氏菌LH430,可稳定传代,能够在体外有效传递和表达目的基因及蛋白。经体外试验验证,LH430/pEGFP-RGD-MEL可促进细胞凋亡,对B16细胞的增殖、迁移和趋化有较强的抑制作用。经荷瘤小鼠模型体内试验验证,LH430/pEGFP-RGD-MEL瘤内注射免疫荷瘤小鼠后,可在体内高效、稳定表达目的基因及蛋白,对肿瘤的靶向性较好,对机体其他组织器官伤害较小。试验证明了重组减毒沙门氏菌在肿瘤动物模型内的表达规律及其对黑色素瘤的靶向治疗作用,为比较医学和人类肿瘤基因治疗提供新的研究思路和方法。