论文部分内容阅读
目的:胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤,其中50%以上是星形细胞起源肿瘤(astrocytic tuomrs,AT)。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)是星形细胞特有的一种中间丝蛋白,不仅特异性地高表达于分化成熟的星形细胞,也一定程度地表达于AT的肿瘤细胞,并可作为该类肿瘤的特异性标志物。已知随AT恶性程度增加及肿瘤细胞去分化加重,肿瘤细胞中GFAP启动子的启动效率明显降低,其GFAP表达也相应减少。本研究检测和比较了 GFAP启动子不同区段在恶性AT细胞系(TJ905细胞)、经NGF诱导向神经元分化的PC12细胞系(PC12细胞)及非肿瘤细胞系(HEK293细胞)中的转录启动效率,旨在筛选并优化对恶性AT有高度组织特异性,并能高效启动下游治疗基因表达的启动子,以便通过增强治疗基因表达的组织特异性来提高恶性AT基因治疗的生物安全性。方法:①以健康人外周血白细胞DNA为模板,在耐热DNA聚合酶的作用下,经PCR扩增获得GFAP启动子-1660～+16区DNA片段(GFAPp)。②将GFAPp亚克隆并插入报导基因载体pEGFP-1及pGL3-Basic中,构建GFAPp转录活性定量及定性检测用报导质粒pEGFP-GFAPp和pGL3-Basic-GFAPp。③设计引物并在其5’端均加入HindIII位点(AAGCTT),以pEGFP-GFAPp为模板,在能产生平滑末端的EasyPfu高保真DNA聚合酶的作用下,依次经PCR扩增获得另外5个GFAPp的不同区段-1549-+16(GFAPp1)、-1297～+16(GFAPp2)、-985～+16(GFAPp3)、-811～+16(GFAPp4)和-660～+16(GFAPp5)。④而后将GFAPp1～5分别亚克隆并插入报导基因载体pEGFP-1及pGL3-Basic中,构建GFAPp1～5启动子区段转录活性定量(pEGFP-GFAPp1、pEGFP-GFAPp2、pEGFP-GFAPp3、pEGFP-GFAPp4、pEGFP-GFAPp5)及定性(pGL3-Basic-GFAPp1、pGL3-Basic-GFAPp2、pGL3-Basic-GFAPp3、pGL3-Basic-GFAPp4、pGL3-Basic-GFAPp5)检测用报导质粒。⑤分别用携带GFAPp和GFAPp1～5启动子区段的转录活性定量或定性检测报导质粒,瞬时转染HEK293细胞、TJ905细胞及PC12细胞,对以上6个GFAP启动子区段的转录活性进行定性和定量检测,以确定它们的转录启动效率。结果:①经PCR扩增成功获得了 GFAP启动子区不同长度的6个目的区段,分别为-1660～+16(GFAPp)、-1549-+16(GFAPp1)、-1297-+16(GFAPp2)、-985-+16(GFAPp3)、-811～+16(GFAPp4)和-660～+16(GFAPp5),经琼脂糖凝胶电泳及测序证实各自的序列与GenBank中对应序列完全一致。②成功构建了用于GFAPp和 GFAPp1～5 转录活性定量(pEGFP-GFAPp、pEGFP-GFAPp1、pEGFP-GFAPp2、pEGFP-GFAPp3、pEGFP-GFAPp4、pEGFP-GFAPp5)及定性(pGL3-Basic-GFAPp、pGL3-Basic-GFAPp1、pGL3-Basic-GFAPp2、pGL3-Basic-GFAPp3、pGL3-Basic-GFAPp4、pGL3-Basic-GFAPp5)检测的报导质粒,经酶切鉴定证实以上报导质粒中目的片段的插入位点及方向正确无误。③定性检测分析显示,HEK293细胞及PC12细胞在转染上述各报导质粒后均无EGFP表达;而TJ905细胞在转染上述各报导质粒后均有EGFP表达,且转染pEGFP-GFAPp、pEGFP-GFAPp4和pEGFP-GFAPp5 者的 EGFP 表达水平高于转染 pEGFP-GFAPp1、pEGFP-GFAPp2和pEGFP-GFAPp3者。定量检测分析显示,在HEK293细胞中6个GFAP启动子区段的转录效率均极低;在PC12细胞中GFAPp及GFAPp1的转录效率明显低于其它区段(P<0.01)并与HEK293细胞相似(P>0.05);在TJ905细胞中6个GFAP启动子区段的转录效率均明显高于前两种细胞系(P<0.001),且GFAPp4及GFAPp5的转录效率高于其它区段(p<0.001)。结论:①GFAP启动子GFAPp、GFAPp4和GFAPp5区段在恶性AT中仍有较强的转录活性。②在恶性AT细胞系中,保留GFAP启动子完整的B区对维持该启动子的高效转录启动活性是十分重要的。③在恶性AT细胞系中,GFAP启动子的-1297至-1549区有调控该启动子启动下游目的基因特异性表达的关键元件。④在恶性AT细胞系中,GFAP启动子的C1～C3区的综合作用是抑制该启动子的转录启动活性。⑤GFAP启动子的C4-C6区段中-842～-638区不影响该启动子在恶性AT细胞中转录启动活性,同时对GFAP启动子的转录具有细胞特异性。⑥GFAPp5转录效率高、长度短,具有AT细胞的转录启动特异性,可作为启动治疗性基因表达的组织特异性启动子,用于恶性AT的基因治疗。