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本论文以一株由自然界筛选获得的能够利用糖质原料产L-丝氨酸的菌株SYPS-062为研究对象,采用形态学、生理生化性状分析和16SrDNA基因序列分析对细菌SYPS-062的分类地位进行了研究,确定了SYPS-062在分类学上的地位为谷氨酸棒杆菌属。构建了谷氨酸棒杆菌L-丝氨酸代谢网络,分析SYPS-062的代谢通量的分布特点,并且根据代谢通量分析结果对关键酶基因进行深入分析,得到如下结果:
1、采用形态学、生理生化性状分析和16SrDNA基因序列分析对细菌SYPS-062的分类地位进行了研究,确定了SYPS-062归属于谷氨酸棒杆菌属的分类学地位。为进一步分析SYPS-062积累L-丝氨酸的机制奠定基础,考察了SYPS-062在营养肉汤培养基中的生长情况并绘制了生长曲线。
2、构建了谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum的代谢平衡模型,应用该模型分别计算出SYPS-062L-丝氨酸快速合成阶段及模式菌株ATCC13032同等时期的代谢通量分布情况。结果表明,利用糖质原料积累L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌SYPS-062中仅有6.4%的碳架进入HMP途径,而模式菌株ATCC13032的HMP途径有29.6%的碳架流入,为解释以上两种菌物量积累差异提供了充分证据;磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)节点涉及OAA的回补反应,以上两种菌株在该点的代谢通量分布相近,说明该节点是谷氨酸棒杆菌回补反应的关键节点;3-磷酸甘油酸(G-3-P)是碳架进入L-丝氨酸代谢途径的重要节点,代谢通量分析结果从量的角度说明了两株菌的代谢分布差异,为进一步研究工作提供理论支持。
3、通过代谢通量分析可知,L-丝氨酸代谢支路代谢通量分布差异是导致L-丝氨酸积累的关键因素之一,其中丝氨酸羟甲基转移酶有关L-丝氨酸的降解和菌体代谢过程中一碳单元的生成,是该通路中的关键节点,故选取丝氨酸羟甲基转移酶glyA基因为研究对象,比较了C.glutamicumSYPS-062及模式菌株ATCC13032glyA基因的异同。实验结果表明,SYPS-062和ATCC13032的glyA基因序列同源性为99.54%,说明不同来源的glyA基因高度同源,两种不同来源的glyA基因在大肠杆菌表达得到重组蛋白的比活力存在微小差异,排除了对glyA基因存在较大差异的推测。