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猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus,PCV2)是引起猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)的主要病原,它能损害患病仔猪的免疫系统,引发其他多种病原混合感染或继发性感染,导致猪的繁殖能力严重下降,给养猪业带来了巨大的经济损失。PCV2感染的早期诊断对PCVD的综合防控具有重大意义。目前,针对PCV2病原的快速检测方法主要有胶体金免疫层析试纸法和ELISA检测方法等,其所用抗体主要是基于杂交瘤细胞制备的单克隆抗体,传统单克隆抗体存在生产周期长、成本高、稳定性差等缺点,在一定程度上限制了PCV2快速、高效、廉价的检测方法的研制。而基因工程方法制备的单链抗体具有生产周期短,成本低、易于改造等优点,其有望取代传统单抗用于PCV2新型免疫学检测方法的研制。实验的主要内容与结果如下:1.PCV2 Cap蛋白的纯化及鉴定本实验将重组表达载体pET28a-ORF2转入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析法对目的蛋白进行纯化,并对蛋白进行鉴定。结果显示表达的重组蛋白分子量约26 kDa,主要以可溶形式存在,且能被His单克隆抗体特异性识别,纯化后的重组蛋白纯度比较高。用此蛋白免疫BALB/C鼠,免疫后,经ELISA检测,测得鼠血清中抗体滴度达1∶64000,同时用PCV2抗体检测试纸对鼠血清进行检测,结果为阳性。本实验制备的重组Cap蛋白具有可溶性好、纯度高、免疫原性好等特点,为Cap蛋白单链抗体库的构建提供了必要的实验材料。2.PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选选取免疫效果较好的小鼠脾脏,提取其脾脏总RNA,再以反转录后的cDNA为模板,PCR扩增抗体的重链可变区基因(Heavy chain variable region of antibody,VH)和抗体的轻链可变区基因(Light chain variable region of antibody,VL),经重叠PCR将VH与VL用多肽(G4S)3连接,获得单链抗体基因(Single chain antibody variable region gene fragment,ScFv)。经辅助噬菌体辅助侵染后获得噬菌体单链抗体库,用Cap蛋白作为包被原筛选PCV2单链抗体克隆,获得3株与Cap蛋白特异性反应的噬菌体克隆。取特异性及反应性相对较高的克隆测序,获得PCV2单链抗体基因,并用ELISA鉴定ScFv-P18菌株的诱导表达后粗提物,结果显示获得的粗提物能与Cap蛋白发生反应。本研究表达并纯化到了可溶性PCV2 Cap蛋白,并构建PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库,筛选到具有结合活性的特异性单链抗体,其有望用于PCV2新型快速检测方法的研制。