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目前,由于各种原因导致的慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)患者呈逐年递增趋势。而因急性感染、血流动力学改变、心肌毒性物质等原因导致的急性失代偿性心衰(he acute decompensated heart failure, ADHF)患者已成为心衰患者住院治疗的主要人群。导致ADHF最常见的诱因是急性感染,且以革兰氏阴性菌感染为主,其细胞壁中的脂多糖(lipopolysaccharide, Lps)起关键作用。慢性心衰患者可在院外口服药物维持生活,而心衰急性恶化时必须要住院积极处理,否侧将成为死亡的主要原因。而治疗方式从传统的强心、利尿、扩血管等药物治疗转向了生物活性物质的干预,如间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)、促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factorn, HGF)等。肝细胞生长因子是一种功能强大的心肌营养因子,具有抗细胞凋亡、抑制炎症反应、抗纤维化、促血管生成及促进干细胞归巢的作用。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有强大的旁分泌作用,可分泌多种生物活性因子。在低氧低营养培养体系下培养可使得BMSCs分泌的细胞因子明显增多,再利用Ad-HGF的转染技术使得BMSCs/Ad-HGF条件培养液(conditioned medium, CM)分泌HGF的水平明显增高。本研究拟初步尝试BMSCs/Ad-HGF-CM早期干预是否对ADHF心功能有改善作用。本实验总体步骤：(1)首先分离小鼠骨髓单个核细胞,置入37℃,5%CO2培养箱,72h后半量换液,继续培养至细胞生长汇合率达到80%左右,传代或冻存,光镜下观察细胞形态,并通过流式鉴定细胞表面标志物。取第3代BMSCs转染携带HGF基因的腺病毒(adenovirus-hepatocyte growth factor, Ad-HGF),48h后弃去培养基,用低氧无血清培养24h,并用ELISA测定HGF表达量。结果示：成功分离培养原代BMSCs, HGF基因修饰前后,均成旋涡状形态；流式测定BMSCs阳性表达CD29、CD73和sca-1, CD45阴性表达符合MSCs表面标记物；ELISA测得BMSCs/Ad-HGF-CM的HGF表达量显著高于BMSCs-CM (P<0.001)。(2)先用阿霉素(doxorubicin, Dox)尾静脉注射建立CHF模型,再尾静脉注射Lps诱导建立ADHF模型,然后尾静脉注射BMSCs/Ad-HGF-CM,观察BMSCs/Ad-HGF-CM对ADHF小鼠心功能是否有改善作用,根据各项检测指标数据初步分析及证实其作用。选用50只雄性同周龄昆明小鼠,随机分为Nor组、ADHF组、HGF组、BMSCs-CM组和BMSCs/Ad-HGF-CM组,每组10只。给予ADHF组、HGF组、BMSCs-CM组、BMSCs/Ad-HGF-CM组尾静脉注射Dox,5mg·kg-1/次/周,共6周,累积总剂量30mg·kg-1,建立CHF小鼠模型,第7周给予此四组注射Lps5mg·kg-1,建立ADHF模型,注射完Lps后分别给予三个治疗组注射HGF、BMSCs-CM、BMSCs/Ad-HGF-CM,同时Nor给予等量生理盐水。各组行心脏超声检查、血浆BNP和IL-6含量测定、心肌HE染色、Bcl-2/Bax免疫组化测定。结果示：与ADHF组相比,BMSCs/Ad-HGF-CM组小鼠FS%增高(P<0.05),血浆IL-6水平明显下降(P<0.01),Bcl-2蛋白增加(P<0.05),Bax蛋白降低(P<0.05),血浆BNP水平较显著降低(P<0.01)；与ADHF组相比,BMSCs-CM组与HGF组小鼠FS%增高(P>0.05),IL-6均下降(P<0.05), Bax表达减少(P<0.05),Bcl-2表达增加(P<0.05),BNP降低(P<0.05)。HE染色结果可见BMSCs/Ad-HGF-CM组、HGF组、BMSCs-CM组较ADHF组,心肌间质内炎性细胞浸润明显减少,心肌细胞较多,间质水肿减轻,但三个治疗组之间未见明显差异。 BMSCs组与HGF组比较,各项实验结果均无统计学差异。三个治疗组组间比较,超声心动图各项指标无统计学差异。通过上述实验结果证实：(1)通过细胞形态观察、细胞标记物检测、绿色免疫荧光检查,BMSCs维持了原有的细胞形态及特异性细胞表型；通过ELISA检测,BMSCs/Ad-HGF条件培养液中HGF表达量明显高于单纯BMSCs培养液；通过条件培养技术,增强了BMSCs的旁分泌作用。并且成功制备了BMSCs-CM和BMSCs/Ad-HGF-CM以便下一步体内实验应用。(2)ADHF组小鼠注射HGF、BMSCs-CM、BMSCs/Ad-HGF-CM后,炎性因子减少,促凋亡基因降低,抗凋亡基因增多,BNP下降,心脏超声显示心功能改善,但HGF组与BMSCs-CM组各项检测比较无统计学差异；与HGF组和BMSCs-CM组相比,BMSCs/Ad-HGF-CM组小鼠炎性反应减轻,心肌细胞凋亡减少,BNP下降,心功能有所改善,但心脏超声指标三组之间无较大差别,HE染色发现心肌组织病理改变无明显差异。由此推测,BMSCs/Ad-HGF-CM可能通过抑制炎性因子释放和抗心肌细胞凋亡对ADHF小鼠心功能起到早期的保护作用,且显示其在抑制炎性反应和抗细胞凋亡方面优于HGF和BMSCs-CM。