丹酚酸B的降解机理及纯化工艺研究

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丹参是唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根茎,是一味传统中药,《中华人民共和国药典》(2005版)记载丹参具有“祛瘀止痛,活血通经、清心除烦”等功效。丹酚酸B是丹参中含量最高的酚酸成分,有很强的生物活性,特别是在抗氧化、清除自由基方面具有很高的药用价值。但丹酚酸B不稳定,易降解,不仅降低制剂的临床疗效,也给丹酚酸B的临床应用带来安全隐患,已成为丹酚酸B产业化的瓶颈。本文以反应动力学和热力学为理论基础,运用HPLC、LC-MS和NMR等现代分析手段,系统研究了丹酚酸B的降解动力学特征和降解机理。在此基础上,对丹酚酸B的提取纯化工艺进行初步探索和优化。首先,研究了丹酚酸的降解现象,并利用LC-MS对其中11种成分进行鉴定。实验结果表明,在加热过程中丹酚酸含量随加热时间延长不断变化,主要规律是丹酚酸A、B、E等缩合酚酸含量不断减少,丹参素、原儿茶醛、咖啡酸等含量不断增加,紫草酸及其同分异构体的含量先增加后减少,表现为中间产物的动力学行为。pH是影响缩合酚酸降解的主要因素,在pH2.0-3.0时缩合酚酸较为稳定,在其它pH条件下,缩合酚酸的降解速率明显增大,多酚酸相似的稳定性趋势是由相近的化学结构决定的。其次,研究了缓冲盐浓度、溶液的pH、温度等对丹酚酸B降解的影响。实验结果表明,丹酚酸B降解符合一级动力学特征,降解速率随缓冲盐浓度的增加而线性增大。pH-速率图是“S”型曲线,在pH2.0时最为稳定;当pH<2.0时,丹酚酸B降解速率随pH减小而加快,表明主要受到H+催化作用;当pH2.0-7.0时,丹酚酸B降解速率随pH增大而加快,表明受OH-催化作用。丹酚酸B的降解速率随温度升高而加快,Arrhenius公式拟合结果表明,在pH2.0-4.0条件下,丹酚酸B降解活化能是40-85kJ/mol,处在酯水解能量范围内。再次,用HPLC制备了丹酚酸B的降解产物并进行了结构鉴定,得出了丹酚酸B的降解机理。1H(13C)-NMR鉴定结果表明,丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、紫草酸和丹酚酸E是丹酚酸B的主要降解产物。丹酚酸B主要降解途径是酯水解和苯并呋喃开环,其中丹参素、紫草酸是水解产物,原儿茶醛是氧化产物,丹酚酸E是苯并呋喃开环产物。在此基础上,研究了微波干燥丹参鲜药材和丹酚酸B的提取、纯化工艺。首先,以丹酚酸B的溶出速率为指标,首次考察了微波干燥丹参鲜药材结合冷浸提取提取丹酚酸B的工艺。结果表明,微波干燥的最佳功率为650W,与晒干药材相比,微波干燥药材中丹酚酸B的溶出速率可提高117%,并获得较高的提取率。其次,以丹酚酸B的回收率和分配系数为指标,考察了不同乙醇/硫酸铵双水相体系的萃取效果。结果表明,分配系数和回收率均随硫酸铵和乙醇质量分数的增大而增大,随pH增大先增大后减小。在pH2.0的粗提液中,当硫酸铵和乙醇的质量分数分别为25%和20%时,分配系数为95.58,回收率为97.93%,证明双水相萃取丹酚酸B是可行的。再次,用吸附动力学和热力学方法研究了聚酰胺树脂对丹酚酸B的吸附特性,对影响吸附的因素,如丹酚酸B的初始浓度、平衡时间、吸附溶液的pH、温度等进行了考察。实验结果表明,聚酰胺树脂对丹酚酸B的吸附等温线符合Langmuir吸附等温线,在初始浓度分别为0.16、0.43、2.66mg/mL时,聚酰胺树脂对丹酚酸B的吸附量分别为69、196、376mg/g。丹酚酸B在聚酰胺树脂上的吸附过程符合二级吸附动力学特征。pH显著影响丹酚酸B的吸附量,当pH<3时,为高吸附量区,3<pH<5时,为过渡区,吸附量随着溶液pH增大而锐减,当pH>5时,为低吸附量区。这种吸附行为表明氢键和静电吸附是产生吸附的主要作用。吸附热力学研究表明,聚酰胺树脂对丹酚酸B的吸附是一个放热过程,ΔH=-50.0kJ/mol;是一个熵减少过程,ΔS=-147.3J/mol;是一个自发过程,在25,30,35,45℃时,Gibbs自由能(ΔG)分别为-6.17,-5.40,-4.64和-3.22kJ/mol,Gibbs自由能随温度升高而减小,表明升高温度不利于吸附的进行。最后,研究了聚酰胺树脂为介质纯化丹酚酸B的柱层析工艺,对影响层析效果的主要因素,如聚酰胺树脂粒度、药液的pH、药液浓度和流速等进行了优化。实验结果表明,如果以大颗粒聚酰胺树脂(60-100目)为介质,最佳流速是1mL/min,药液浓度是2.4mg/mL,pH为2.0,以3倍柱体积(3BV)水除杂、以1BV 20%和5BV 70%乙醇洗脱,收集70%洗脱液,浓缩除醇,冷冻干燥,得含量为53.53%的丹酚酸B,收率为83.00%,对药材收率为2.29%左右。如果以小颗粒聚酰胺树脂(100-200目)为介质,流速为3.5mL/min,以3BV水除杂,以1BV 20%、1.5 BV 50%和1.5-4BV 70%乙醇洗脱,收集含丹酚酸B的70%洗脱液,浓缩除醇,冷冻干燥,得含量大于95%的丹酚酸B,收率为30%。总之,本研究结果表明,丹酚酸B的酯水解和苯并呋喃开环是丹酚酸B降解的主要途径,温度和pH是影响丹酚酸B稳定的主要因素;微波干燥丹参鲜药材与冷浸提取相结合,可加快丹酚酸B的溶出速率,双水相萃取与聚酰胺树脂层析相结合可实现对丹酚酸B的纯化。本研究为丹酚酸B的药用开发提供了科学依据。
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