鼻咽癌侵袭转移相关核酸适配体的实验研究

来源 :暨南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yuxuan1991
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目的:  鼻咽癌是我国南方常见的头颈恶性肿瘤。鼻咽癌具有高转移、高复发和低分化的临床特征,鼻咽癌高转移严重影响了鼻咽癌的有效治疗。寻找鼻咽癌转移相关分子标物,预测鼻咽癌转移并及早干预,对提高鼻咽癌的治疗疗效具有极为重要的意义。核酸适配体是通过SELEX技术筛选获得的一类特异性性识别靶标的单链DNA或RNA,为鼻咽癌转移分子标志物的筛选提供了重要的研究手段。本研究基于cell-SELEX技术,以鼻咽癌转移细胞株5-8F为细胞模型,以筛选出特异性的转移核酸适配体,为鼻咽癌转移性早诊断和靶向治疗寻找新的分子标志物。  方法:  本研究用cell-SELEX技术,以高转移鼻咽癌细胞株5-8F为靶细胞进行正向筛选,低转移鼻咽癌细胞株6-10B为对照细胞进行反向筛选。通过15轮筛选后,用流式细胞仪分析与鼻咽癌细胞5-8F核酸适配体的结合能力。最后经高通量测序挑选出重复性高的序列进行实验验证,从而获得与靶细胞5-8F特异性结合而不与对照细胞6-10B结合的核酸适配体。  结果:  (1)富集ssDNA文库中PCR扩增退火温度优化,退火温度区间为55-62℃。根据琼脂电泳目的条带的亮度,确定59℃为最佳退火温度。  (2)富集ssDNA文库中PCR扩增循环数优化,循环数的优化区间为4、6、8、10、12、14、16。每轮筛选进行扩增前,通过琼脂电泳确定每轮筛选扩增的最佳循环数。  (3)通过不断调整筛选压力,流式细胞仪验证第15轮筛选获得与鼻咽癌细胞5-8F特异性结合的ssDNA。高通量测序结果表明,筛选后ssDNA文库有较好的富集,前5条序列的重复率占比47%,在经流式细胞仪确认特异性结合鼻咽癌细胞5-8F的核酸适配体。  (4)通过流式细胞仪验证,seq4、seq5序列被确认能特异性结合鼻咽癌细胞株5-8F核酸适配体。  结论:  本研究成功地将Cell-SELEX技术用于核酸适配体筛选,并获得鼻咽癌转移特异核酸适配体。核酸适配体seq4、seq5序列被确认能特异性结合鼻咽癌细胞株5-8F核酸适配体。seq4、seq5序列可能是鼻咽癌转移特异的核酸适配体。
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