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目的:氧化应激在百草枯（paraquat, PQ）中毒发病机制中的作用已得到广泛认同，核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2）作为调节细胞内氧化-抗氧化平衡的关键转录因子参与PQ肺损伤的病理生理过程。研究其调节方式及机制将有助于深化对PQ中毒发病机制的认识。积累的资料表明，沉默信息调节因子1(silent information regulator1，Sirt1)可通过多种途径调节抗氧化分子的表达，并且与Nrf2的稳定性和活性关系密切，有可能由此参与Nrf2介导的氧化应激的调节过程。本研究旨在通过体外实验，证明Nrf2与Sirt1蛋白间存在相互作用的前提下，运用基因转染技术调节二者的表达，探讨Sirt1/ARE/Nrf2信号通路对于PQ中毒小鼠肺损伤的保护作用，为PQ中毒肺的抗氧化损伤治疗提供理论依据。 方法:实验一:培养小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮细胞，用PQ暴露后，利用免疫共沉淀技术(co-immunoprecipitation，CO-IP)，分别以Nrf2和Sirt1作为一抗，正反验证在氧化应激条件下，Nrf2蛋白与Sirt1蛋白是否具有相互作用;构建携带Nrf2和Sirt1基因的过表达慢病毒载体。实验二:通过绿色荧光表达量验证慢病毒载体的转染效率，并以PCR和Western-blot技术分别从基因和蛋白水平检测Nrf2及Sirt1的表达情况，进一步验证过表达慢病毒载体构建。实验三:利用骨髓间充质干细胞系(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)较强的迁移能力及向受损肺组织“归巢”的特性，建立携带Nrf2、Sirt1的BMSC系，再用其对PQ中毒小鼠进行干预。145只ICR小鼠分为以下8组:①空白对照组②NS组③PQ组④PQ+NS组⑤PQ+LV-MSC-GFP组⑥PQ+LV-MSC-Nrf2组⑦PQ+LV-MSC-Sirt1组⑧PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1组。分别于PQ染毒后3d、7d、14d、21d麻醉处死，每组每个时间点各5只，空白对照组直接麻醉处死，取肺组织。运用PCR和Western blot技术分别从基因和蛋白水平观察Nrf2及Sirt1的动态改变;化学比色法检测肺组织MDA、SOD、CAT、GSH含量或活性;ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β1水平;光镜联合透射电镜观察小鼠肺组织损伤情况。 结果: 1.CO-IP正反实验表明，PQ暴露的Ⅱ型肺泡上皮细胞，Nrf2蛋白与Sirt1蛋白有相互作用。 2.通过荧光显微镜观察绿色荧光表达情况，各过表达慢病毒载体转染组转染效率均在80％以上，LV-Nrf2和LV-Sirt1感染骨髓间充质干细胞后，PCR和Western-blot技术显示LV-Nrf2和LV-Sirt1在感染的骨髓间充质干细胞中基因和蛋白表达量明显升高(P＜0.01)。 3.空白对照组与NS组、PQ组与PQ+NS组数据高度类似，不再重复比较;PQ+LV-MSC-GFP组与PQ组无明显差异。 (1)与空白对照组比较，3d时，PQ组Nrf2、Sirt1基因及蛋白表达量明显升高（P＜0.05）;与PQ组比较，PQ+LV-MSC-GFP组Nrf2、Sirt1基因表达量基本无改变，而蛋白表达水平稍高，但无统计学意义; PQ+LV-MSC-Nrf2组、 PQ+LV-MSC-Sirt1组、PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1组Nrf2、Sirt1基因及蛋白表达量均明显升高（P＜0.05），其中PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1组最高。随着时间的推移，各组其表达量逐渐降低，至21d，PQ组较各干预组相比Sirt1和Nrf2的水平更低。 (2)肺组织匀浆中:与空白对照组比较，PQ组MDA含量明显升高，SOD、CAT活性均较低，GSH含量下降;与PQ组比较，基因转染干预后MDA含量明显下降，SOD、CAT活性，GSH含量明显升高。 (3) ELISA结果显示:与空白对照组小鼠血清比较，PQ组3d时TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β1明显升高(P＜0.05)，TNF-α、IL-1β升高的幅度整体高于IL-10、TGF-β1，随着时间的推移，各炎症因子含量逐渐下降，21d时，已与空白对照组差异不大;与PQ组比较，相同时间点，PQ+LV-MSC-Nrf2组、PQ+LV-MSC-Sirt1组、PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1组TNF-α、IL-1β含量较低（P＜0.05），而IL-10、TGF-β1含量明显升高（P＜0.05），其中PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1组干预效果最好。 (4) PQ染毒后，PQ小鼠出现倦怠少动，反应迟缓，毛色于枯，呼吸急促等表现;采用Sirt1或Nrf2基因干预后均可明显改善以上中毒症状，联合Sirt1和Nrf2干预组与正常小鼠表现相似。PQ中毒小鼠的肺组织出现明显的炎症和出血，ACE-Ⅱ细胞损伤严重;采用Sirt1或/和Nrf2进行干预后明显改善肺组织损伤和炎症反应，利于ACE-Ⅱ修复。 结论:PQ中毒后小鼠肺组织Sirt1与Nrf2均轻度反馈性升高，随后迅速降低.，促炎症介质大量释放，氧化应激指标明显上升。通过重组慢病毒调控Sirt1/ARE/Nrf2信号通路，可以明显降低氧化应激酶的活性及氧化应激产物的生成。Sirt1与Nrf2存在互相调节作用，调节二者其一，均可减轻PQ中毒氧化应激导致的肺损伤，同时上调两者表达效果最佳。