近年来，随着干细胞、组织工程和再生医学的迅猛发展，生物起搏器成为心脏起搏的热点研究。生物起搏器，是指采用具备起搏功能的细胞或组织来取代病损的起搏或传导组织已达到重建心脏起搏或传导功能的目的，以此实现组织的修复和再生。生物心脏起搏器避免了人工电子起搏器的许多不足，将成为以后治疗各种心律失常的理想选择及发展方向。　　目前，构建生物心脏起搏器的方法包括：基因转染、细胞移植和组织工程体外构建等。这些方法的基础和关键是找到理想的种子细胞。干细胞因其不可比拟的优势成为种子细胞的主要来源。　　有文献报道，棕色脂肪源性干细胞（brown adipose-derived stem cells,BADSCs）具有高度的自发心肌分化能力。本实验室的前期工作证实：这种自发分化的心肌细胞其中有一部分具有起搏细胞的生物特性及功能。因此，BADSCs成为构建生物起搏器理想的种子细胞来源。胶原海绵、明胶海绵、水凝胶是三种常用于组织工程构建的支架材料，已被证实具备良好的生物相容性与可降解性，完全可用于体内外构建生物起搏器。　　因此，本课题旨在前期工作基础上探讨纯化BADSCs源性起搏细胞、提高起搏细胞获得率的方法；进一步探讨起搏细胞的分化机制，在体外构建组织工程化起搏器，为下一步体内构建生物心脏起搏器奠定基础。　　第一部分 起搏细胞的分选和纯化　　目的：寻找纯化BADSCs源性起搏细胞的方法，获得纯度较高的起搏细胞。　　材料和方法：取4-5周C57BL/6小鼠肩胛间棕色脂肪组织，经0.1℅Ⅱ型胶原酶消化，离心收集细胞，15℅FBS培养基重悬后置于37℃，5℅CO2培养箱中培养。分别采用流式细胞分选术、免疫磁珠分离技术、机械式刮除法纯化起搏细胞。取新鲜分离的BADSCs，使用流式细胞分选术分选出CD166+细胞，用含15℅FBS培养基重悬后置于37℃，5℅CO2培养箱中常规培养；将收集的BADSCs培养至第14天，再用免疫磁珠分离技术分选出HCN4阳性的细胞，继续进行培养；将BADSCs培养至第14天，机械式刮取跳动的细胞，RT-PCR、Western Blot分析起搏和心肌相关特异基因、蛋白表达。　　结果：1.经流式细胞分选仪分选的CD166+细胞培养至14天一直没有贴壁；2.常规培养至14天，免疫磁珠分选出的HCN4+细胞，随着培养时间的延长细胞呈细长拉丝状，折光性不佳，至14天时未出现搏动现象；3.机械式刮除法中，RT-PCR结果显示起搏细胞标志物Cx30.2、HCN4在实验组细胞的表达高于对照组细胞，心肌细胞标志物Sr、TropninT较对照组下降，Western Blot也进一步验证了这一结果起搏细胞起搏细胞。　　结论：试图使用HCN4、CD166等标志物，通过免疫磁珠分离技术、流式细胞分选术纯化起搏细胞效果不甚理想；机械式刮除法提高了起搏细胞的获得率，达到了纯化起搏细胞的目的。　　第二部分 阻断经典Wnt通路对BADSCs向起搏细胞分化的影响　　目的：研究阻断经典Wnt信号通路对棕色脂肪干细胞向起搏细胞分化的影响。　　材料和方法：取4-5周C57BL/6小鼠肩胛间棕色脂肪组织，经0.1%Ⅱ型胶原酶消化，离心收集细胞，原代培养BADSCs至10天，设为对照组；实验（诱导）组培养基中加入Dkk-1（经典Wnt信号通路阻断剂）培养至10天。相差显微镜下，观察诱导组细胞形态变化情况和程度；Real-time PCR检测起搏细胞发育相关结构基因的表达；免疫荧光染色观察起搏细胞特征分子的蛋白表达。　　结果：Real-time PCR结果表明，经Dkk-1诱导10天后，BADSCs中表达的起搏细胞特异基因Tbx18,Tbx3,Shox2,Cx30.2，Sarcomericα-actin(Sr),HCN4，Tnnt2(cTNT)明显高于对照组；免疫荧光结果显示，Dkk-1组，起搏细胞特异蛋白HCN4和Sr阳性表达率显著高于对照组。　　结论：经典Wnt信号通路可的BADSCs向起搏细胞分化的过程中起抑制作用。　　第三部分 组织工程起搏器的体外构建　　目的：研究三种不同支架材料对BADSCs向起搏细胞分化的作用及影响，在体外初步构建组织工程起搏器，为进一步在体内构建生物起搏器奠定基础。　　材料和方法：分别以胶原海绵（collagen sponge）、明胶海绵（gelfoam）、水凝胶（hydrogel）为支架材料，以BADSCs作为种子细胞在体外构建细胞-支架复合体；LIVE/DEAD试剂盒检测细胞-支架复合体中细胞的生长增殖状况；HE染色对复合体进行形态学观察；扫描电镜观察细胞-支架复合体表面结构；免疫荧光染色观察支架内细胞起搏和心肌特征分子的蛋白表达。　　结果：BADSCs可以在支架材料中生长、增殖，并表达起搏细胞的相关标志。其中，只有细胞-水凝胶复合体在常规培养14天出现搏动现象；LIVE/DEAD试剂盒检测显示随着培养时间的延长，细胞-支架复合体中起搏细胞数量呈现增殖趋势。同时，死亡细胞数量无明显上升，甚至只出现个别细胞死亡现象；HE染色结果显示起搏细胞相对成团聚集，不太均匀地分布于支架材料内。胶原海绵、明胶海绵中，细胞沿着支架材料边缘处聚集分布，中央区域细胞较少；扫描电镜结果显示，在胶原海绵支架中，细胞与细胞形成连接交织成网似“蚕茧”般覆盖包裹于整个支架表面。明胶海绵组，细胞的增殖明显少于胶原海绵支架。相比之下，水凝胶支架中，细胞均生长在水凝胶内；三种支架材料中的细胞表达起搏细胞发育相关特异基因HCN2、HCN4、Connexin45（Cx45）、Sarcomericα-actin（Sr），具有起搏细胞特性。　　结论：BADSCs在三种支架材料内均能生长、增殖并分化为起搏细胞，与三种支架材料有良好相容性。相比而言，细胞-水凝胶支架可产生搏动，可能更适用于组织工程起搏器的构建。