光是植物光合作用的唯一能源,是植物生命活动的基础。然而,当植物吸收的光能过剩,超过其电子传递所需时,过剩光能便会造成光合效率和光合功能的降低,严重时还会发生光氧化破坏。植物在长期的进化过程中形成了多种光保护机制,可将过剩激发能对光合机构的损伤减小到最低程度,其中叶黄素循环被认为在植物防御光氧化破坏中起着重要作用。所谓的叶黄素循环是指植物吸收的光能过剩时,双环氧的紫黄质(V)在紫黄质脱环氧化酶(VDE)的催化下,经过中间物单环氧的花药黄质(A)转化为无环氧的玉米黄质(Z);在暗处,则在玉米黄质环氧化酶(ZE)的作用下朝相反方向进行,将Z经A重新环氧化为V,形成一个循环。其中紫黄质脱环氧化酶(VDE)和玉米黄质环氧化酶(ZE)是该循环的关键酶。因此,弄清叶黄素循环的功能以及该循环的调控机理具有非常重要的意义。本文以番茄(中蔬四号)为材料,利用RT-PCR克隆了番茄玉米黄质环氧化酶基因(LeZE),分析了该基因在番茄中的表达特征。构建LeZE原核表达载体,制备抗体,做Western blotting,研究了该基因在蛋白水平的表达。构建了LeZE基因的正义和反义表达载体,并转化番茄,探讨了LeZE基因过量表达对转基因植株耐低温弱光和强光胁迫能力的影响。主要结果如下:1.根据已知序列设计特异引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片中克隆了番茄玉米黄质环氧化酶基因的cDNA全序列。测序结果显示,番茄ZE的cDNA全长2284 bp,在5’端有一段29 bp的非编码区,第2037~2039个碱基处为该基因的终止密码子TAA,其后有一段245个碱基的非编码区;该基因的编码区为2010 bp,推测其编码669个氨基酸。该基因被命名为LeZE。2.同源序列比较发现,玉米黄质环氧化酶的氨基酸序列与马铃薯、烟草、胡萝卜、葡萄、菊花和杏同源性较高,分别为96.1%、89.7%、75%、74%、72.5%和71.2%;但与水稻的同源性则较低,仅为66.6%。3.提取番茄不同部位(叶片、花瓣、茎、根和果实)总RNA,以LeZE 3’端约400 bp序列为探针,进行Northern杂交。结果表明LeZE在叶片中表达量最高,在果实和茎中表达量较低,而在根和花瓣中几乎不表达。此外,LeZE的表达不受光强和温度的诱导,而是受昼夜节律的影响。4.将获得的番茄玉米黄质环氧化酶基因与原核表达载体PET-30a重组,构建原核表达载体。以原核表达所得重组蛋白注射小鼠,制备抗体。分别对低温弱光和强光处理的番茄蛋白进行了Western杂交分析。结果表明,LeZE在蛋白水平的表达始终处在同一水平,基本不受光强和温度的影响。5.将获得的番茄玉米黄质环氧化酶基因与含有35S启动子的PBI121载体重组,构建了正义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转入番茄中,通过1%的卡那霉素筛选,获得了番茄转基因苗。用Northern杂交进行检测,获得了转正义LeZE植株。Northern和Western杂交表明,转正义基因株系的LeZE的RNA水平和蛋白水平与野生型相比都明显增高。对野生型和转基因番茄两个株系分别进行强光及低温弱光处理。在胁迫处理过程中野生型和转正义基因株系的NPQ及叶黄素循环脱环氧化状态(A+Z)/(V+A+Z)都增加,但野生型较转正义基因株系的NPQ和(A+Z)/(V+A+Z)增加更加明显。结果表明,在低温弱光及强光胁迫条件下,依赖叶黄素循环的NPQ能够耗散过剩激发能,而转基因株系比野生型耗散能力下降;强光处理过程中,与野生型相比转正义基因株系的Fv/Fm降低更明显,且野生型的Fv/Fm恢复较快,转基因株系的Fv/Fm恢复较慢。低温弱光处理时,野生型和转基因株系Fv/Fm降低程度基本相同,但恢复过程中野生型的Fv/Fm恢复较快,这表明LeZE的过量表达加重了PSII的光抑制程度,与野生型相比,转基因番茄的PSII反应中心受伤害较严重;强光胁迫6 h和12 h,野生型和转基因番茄的放氧速率降低非常显著,低温弱光处理6 h和12 h,野生型和转基因番茄的放氧速率都降低,但下降程度不如强光处理下的明显。这表明由于LeZE的过量表达降低了低温弱光和强光胁迫下放氧复合体的稳定性,使光合机构所受到的伤害加重。玉米黄质环氧化酶基因在RNA水平上的表达量与合成新的有活性的ZE蛋白有关。因此转正义基因株系中LeZE的过量表达使其RNA的表达量急剧上升,有活性的ZE蛋白含量随之增加,从而使玉米黄质(Z)的消耗速率加快,光下积累量减少,导致转正义基因株系在过剩光能存在条件下的脱环氧化状态降低。因此,转正义基因株系依赖叶黄素循环的热耗散功能下降, PSII的光抑制程度加重,对过剩光能的敏感性增加。