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结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病,由T淋巴细胞介导的细胞免疫对结核病的发病、演变及转归有决定性影响。γδT细胞作为连接天然免疫和适应性免疫的T淋巴细胞,在抗结核菌感染中发挥重要作用。γδT细胞表面的γδT受体(γδT Cell Receptor, γδTCR)和自然杀伤细胞活化型受体2D (Natural killer group2member D, NKG2D)介导γδT细胞的抗感染过程。作为这些受体的配体,结核菌的蛋白抗原和被结核菌感染的细胞表面应激分子激活了γδT细胞的抗结核免疫反应。但是,γδT细胞通过γδTCR识别结核菌抗原,并通过NKG2D识别被结核菌感染细胞上的UL16结合蛋白(UL16binding protein, ULBP)分子,从而将天然免疫和适应性免疫连接起来抵抗结核菌感染的机制尚未完全澄清。本实验室前期的研究结果表明,γδT细胞很可能通过γδTCR的互补决定区3(Complementary determining region3, CDR3)识别结核菌蛋白Rv1194c,所以,我们对该蛋白进行原核重组表达,来研究γδT细胞通过γδTCR识别结核菌抗原的机制。同时,我们建立了鼠类ULBP样转录本1(Murine ULBP-like transcript1, MULT1)转基因小鼠,拟通过过量表达ULBP的类似物MULT1,来研究γδT细胞识别ULBP的机制。考虑到结核菌以慢性感染为主的特点和γδT细胞在体外不能长期存活的局限,我们决定对γδT细胞进行永生化培养,以期得到生长期限延长的γδT细胞,而便于在体外研究机体在抗结核菌慢性感染的过程中γδT细胞所起的长期作用。本文有三部分研究内容：结核菌重组蛋白的原核表达和鉴定,两个品系转基因小鼠的传代和鉴定,人γδT细胞的永生化。本文的科学意义在于：获得了对人γδT细胞有扩增作用的结核菌蛋白、获得了稳定传代的阳性转基因小鼠和生长时限延长至50天的人γδT细胞,从而为后续研究人γδT细胞抗结核菌感染的机制打下了基础。为阐明γδT细胞通过其受体γδTCR识别结核菌蛋白而介导抗结核菌感染的机制,我们对结核菌H37Rv株重组蛋白Rv1194c进行了原核表达和鉴定。在设计引物和得到模板后,我们通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)获得了目的基因扩增产物。检测基因序列正确后,我们将目的基因连接表达载体并转化表达菌株,最后使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。对表达产物鉴定后,我们对目的蛋白的可溶部分和包涵体部分进行了提取纯化并初步研究了蛋白的功能。结果发现,天然状态下提取的包含目的蛋白的可溶性蛋白混合物能够刺激人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的yδT细胞扩增。为阐明γδT细胞通过其受体NKG2D识别被结核菌感染细胞所表达的ULBP等分子的机制,我们建立了Mult1/Mult1S转基因小鼠模型(MULT1为人类ULBP分子在小鼠中的类似物),旨在通过过度表达MULT1/MULTS,来观察两种转染基因Mult1/Mult1S在组织中的表达及其对免疫系统的影响,以了解它们与γδT细胞受体NKG2D结合,并介导γδT细胞抗结核菌感染的机制。通过将雄性的转基因小鼠与雌性的野生型小鼠合笼,并且对这些小鼠的后代进行基因型鉴定,我们获得了稳定传代的转基因小鼠用于后续实验。为研究γδT细胞在机体漫长抗结核菌感染中的长期作用,需得到能够在体外长期存活的γδT细胞。我们用电转染和逆转录病毒感染法将人类γδT细胞进行永生化。在成功构建了人端粒酶逆转录酶催化亚基基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)重组表达载体pRevTRE-hTERT之后,我们对γδT细胞分别进行了电转染和逆转录病毒感染,然后加入强力霉素诱导hTERT基因表达,从而使γδT细胞永生化。结果发现,人γδT细胞的存活期限延长至50天。其间,我们对电转染条件进行了优化,获得了稳定产毒的细胞阳性克隆。综上所述,本研究主要取得了如下结果：1.获得了结核菌H37Rv株重组蛋白Rv1194c的原核表达产物,并初步发现该产物对人γδT细胞有扩增作用。2.获得了16只Mult1S阳性和5只Mult1阳性的杂合子转基因小鼠用于后续研究。3.获得了生长时限延长至50天的人γδT细胞,积累了人γδT细胞永生化的经验。我们通过表达结核菌重组保守蛋白Rv1194c,来研究人γδT细胞表面受体γδTCR识别结核菌抗原的机制；我们借助过量表达MULT1的转基因小鼠,来研究γδT细胞表面受体NKG2D识别ULBP应激分子的功能；我们的研究首次表明,使用外源hTERT基因重组的方法可以延长人γδT细胞的生长期限。总之,我们的研究为阐明γδT细胞抗结核菌感染的机制奠定了基础。