Onconase,也称作P-30蛋白,是一种提取自北极豹蛙胚胎的强碱性核糖核酸酶。它由104个氨基酸组成,氨基酸序列与三维结构分析显示它属于牛胰腺核糖核酸酶A超家族。但Onconase与RNase A也存在不同之处:(1)Onconase含有牛胰腺核糖核酸酶A超家族特有的Cys87-cys104二硫键,该二硫键使其C端残基折向中央的β折叠片而形成了onconase特有的结构(2)Onconase的N端含有焦谷氨酸残基。该非编码的残基是由当Onconase N端的谷氨酰胺暴露时自动环化形成的。该环化结构为Onconase生物活性所必须的结构。Onconase对肿瘤细胞具有细胞毒性和细胞抑制性,能够较好地抑制裸鼠体内移植肿瘤细胞的生长。尽管其细胞毒性的机理仍未完全搞清楚,但Onconae的阳离子性和核糖核酸酶抑制剂的不亲合性是其具有细胞毒性的重要原因。阳离子性能够使Onconase与肿瘤细胞的表面阴离子结合,核糖核酸酶抑制剂的不亲合性能够使通过胞吞作用进入细胞质内的Onconase降解靶RNA(主要是tRNA)。抑制蛋白质生物合成最终导致肿瘤细胞凋亡。最近有文献报道,非编码RNA也与Onconase介导的细胞凋亡有关。目前临床上使用的Onconase均为从北极豹蛙的卵细胞中提取,纯化过程费时又耗力,包括:排卵、提取卵母细胞、体外授精、匀质化、阴离子交换层析、阳离子交换层析和分子筛等步骤。重组DNA技术为许多治疗性蛋白的生产提供了一种有效的替代方法。文献报道利用大肠杆菌表达系统表达的Onconase不能够正确折叠,表达产物最终以包涵体的形式分泌。另外,利用大肠杆菌表达的Onconase在其N端含有多余的Met,该残基阻止了Onconase N端环形结构的形成。为了获得有活性的Onconase,必须对包涵体进行变性、复性和去除N端Met的复杂操作,利用大肠杆菌表达Onconase的产量约为5-50 mg L-1培养基。本研究包括以下3方面的内容:(1)优化Onconase的表达:韩国的Kim等利用PHO1作为分泌信号引导Onconase在巴斯德毕赤酵母中表达,但α交配因子是目前巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白时最常用的分泌信号,研究发现选择合适的分泌信号对于外源蛋白的表达量会产生很大的影响。因此,优化分泌信号是提高Onconase在巴斯德毕赤酵母中表达量的有效方法。(2)评价巴斯德毕赤酵母是否是大规模生产Onconase的最佳宿主:Onconase在巴斯德毕赤酵母中的表达量约为10 mg L-1左右,该表达量与利用其他表达系统时相当。然而,已有大量文献证实采用高密度发酵培养能够将外源蛋白的表达量提高10倍。Onconase具有稳定的化学结构,而对多种蛋白酶的钝化作用使其能够在发酵上清中达到很高的浓度。(3)糖基化和非糖基化形式Onconase活性的比较:过去曾认为糖基化能够增加Onconase结构的稳定性,因此提高了Onconase对K-562的细胞毒性。然而,最新的研究证明onconase的细胞毒性和细胞抑制性主要取决于它的核糖核酸酶活性,因此,糖基化能否提高Onconase细胞毒性需要在正常细胞和其他肿瘤细胞中进一步证实。该研究证明了在巴斯德毕赤酵母中最常用的α交配因子分泌信号并非是Onconase的最适分泌信号:当利用不含EAEA空间结构的α交配因子作为分泌信号时,α交配因子的pro肽部分不能被Kex2蛋白酶从Onconase中正常切除,从而导致表达产物为未经加工的高度糖基化的Onconase前体;当利用含EAEA空间结构的α交配因子作为分泌信号时,α交配因子的pro肽部分能够完全被Kex2蛋白酶从Onconase中正常切除,但是,EAEA空间结构却不能被Ste13蛋白酶从Onconase中切除,导致了Onconase的N端带有多余的空间结构,阻止了其N端环形结构的形成,最终使表达产物没有生物学活性。对于一些N端具有特殊结构的外源蛋白来说,pro肽或EAEA空间结构的不完全切割往往是造成其表达量低或表达产物没有生物学活性的主要原因,然而,目前对于这类蛋白遇到的问题,还没有统一的解决办法。该研究利用α交配因子的pre肽部分作为分泌信号时,目的蛋白产量高,纯化过程简单,且具有良好的生物活性,说明α交配因子pre肽部分的信号肽酶对于Onconase的N端特殊结构不敏感。为上述问题提供了一种解决方法。该策略同样可以用于面临相同问题的其他外源蛋白。通过分泌信号的优化,我们证明了巴斯德毕赤酵母是大规模制备Onconase的最佳宿主。然而,由于糖基化形式对药物免疫原性和药代动力学具有一定的不利影响,因而对于糖基化形式Onconase的应用目前尚还存在很大的争议和不确定性。因此,对于糖基化形式Onconase的研究,还有大量的试验验证需要展开。