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研究背景和目的:胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,其病死率在肿瘤相关死亡率中排第三位。铂类药物作为中晚期胃癌患者的基础化疗药物之一,广泛应用于临床。然而这类患者的5年生存期仍然低于30%,其主要原因是肿瘤细胞耐药及药物不良反应。犹素（Ubiquitin-foldmodifier 1,UFM1）是一个类泛素蛋白,可以修饰底物,使底物发生犹素化修饰。UFM1 结合蛋白 1（UFM1-binding and PCI domain-containing protein 1,UFBP1）是第一个被发现的犹素修饰底物,在犹素修饰系统中起着关键的作用。研究发现UFBP1能促进或抑制与其发生相互作用的蛋白质的泛素化降解,提示UFBP1在泛素修饰系统也发挥着重要作用。近期有文献报道,UFBP1高表达能显著延长胃癌患者的生存期,但具体机制尚不明确。因此,本研究将从探索UFBP1是如何调控胃癌细胞增殖及是否影响胃癌细胞对化疗药物的敏感性入手,通过定量蛋白质组学和多种生化实验逐步揭示UFBP1增加胃癌细胞对铂类化疗药物敏感性的作用机制,并在动物和临床标本中证实该分子机制。本研究旨在阐明UFBP1调控胃癌细胞药物敏感性的新机制,为临床个体化化疗方案的选择提供理论依据。研究方法:我们首先利用慢病毒侵染的方法分别构建稳定过表达和稳定敲低UFBP1的胃癌细胞株及其阴性对照;通过CCK-8细胞增殖和流式细胞周期检测实验考察UFBP1过表达和敲低对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响;通过免疫印迹和CCK-8细胞增殖实验验证胃癌细胞中内源性UFBP1的蛋白表达水平与其对顺铂药物敏感性的关系;通过CCK-8细胞增殖、克隆形成、流式细胞凋亡检测和免疫印迹等实验,考察UFBP1与胃癌细胞对铂类化疗药物敏感性的关系;接着利用细胞培养稳定同位素标记（Stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC）技术探索UFBP1调控胃癌细胞对铂类药物敏感性的下游信号通路;通过免疫印迹实验验证蛋白质组学的实验结果;在胃癌细胞中通过基因沉默同时敲低醛酮还原酶[aldo-keto reductase（AKR）1C]家族基因及UFBP1后利用流式细胞凋亡实验验证AKR1Cs是否参与了 UFBP1对胃癌细胞药物敏感性的调控中;通过qPCR实验进一步考察UFBP1对AKR1C mRNA水平的影响;通过免疫印迹和qPCR实验进一步探索UFBP1对AKR1Cs的核转录因子核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2）的调控关系;在HEK293T细胞中通过双荧光素酶报告基因实验验证UFBP1对Nrf2转录活性的影响;通过免疫共沉淀和免疫印迹实验考察UFBP1与Nrf2是否存在相互作用;通过蛋白合成酶抑制剂放线菌酮（CHX）处理细胞实验,考察UFBP1对Nrf2蛋白质稳定性的影响;通过泛素蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞实验及泛素化实验揭示UFBP1是否促进Nrf2的泛素蛋白酶体途径降解;在胃癌细胞中通过基因沉默同时敲低Nrf2和UFBP1后,利用流式细胞凋亡实验验证Nrf2是否参与了胃癌细胞对铂类化疗药物敏感性的调控;使用Nrf2的特异性激活剂tBHQ预处理胃癌细胞后,再次通过流式细胞凋亡实验考察Nrf2/AKR1Cs在UFBP1调控胃癌细胞对铂类化疗药物敏感性中的影响;最后我们通过小鼠荷瘤实验,在体内验证UFBP1是否是通过Nrf2/AKR1Cs影响胃癌细胞对铂类化疗药物的药物敏感性;通过免疫组化得到术后以铂类为基础化疗药物的胃癌患者肿瘤样本中UFBP1的蛋白表达,利用Kaplan-Meier Plotter生存期分析得到UFBP1的表达与患者的无瘤生存期的关系;通过分析公共数据的数据获得AKR1 Cs和UFBP1的mRNA的表达水平与总生存期的关系。研究结果:通过细胞增殖和细胞周期实验,我们发现UFBP1过表达或敲低并不能影响胃癌细胞的增殖及细胞周期进展;而免疫印迹和顺铂药物处理的细胞增殖实验显示在内源性UFBP1蛋白高表达的胃癌细胞株SGC7901中顺铂处理24 h的IC50值明显低于内源性UFBP1低表达的胃癌细胞株（MGC803、BGC823、HGC27和MKN45）;细胞增殖、克隆形成、细胞凋亡和免疫印迹等实验结果进一步证实UFBP1高表达能显著增加MGC803对顺铂和奥沙利铂的药物敏感性,显著增加顺铂诱导的MGC803细胞凋亡,反之,UFBP1敲低后,SGC7901细胞对顺铂和奥沙利铂的耐药性显著增加,顺铂诱导的SGC7901细胞凋亡显著减少;SILAC定量蛋白质组学实验共鉴定到了 143个受UFBP1调控的蛋白,生物信息学过程分析发现许多蛋白参与了氧化还原反应,其中包括受UFBP1显著下调的AKR1Cs;免疫印迹实验验证了 UFBP1确实能显著下调AKR1C蛋白表达;通过基因沉默实验,我们发现在胃癌细胞SGC7901中同时敲低UFBP1和AKR1C2后,UFBP1不再影响顺铂诱导的细胞凋亡;qPCR实验进一步证实了 UFBP1能显著下调AKR1Cs的mRNA水平;通过免疫印迹实验我们又发现UFBP1高表达能显著下调胃癌细胞中AKR1Cs的转录因子Nrf2的蛋白水平,而UFBP1敲低则能显著增加胃癌细胞中Nrf2蛋白;在HEK293T细胞中,双荧光素酶报告基因实验结果显示UFBP1过表达能显著下调Nrf2的转录活性;qPCR实验结果提示UFBP1不影响胃癌细胞中Nrf2的mRNA水平;多个生化实验的结果证实UFBP1与Nrf2存在相互作用,且UFBP1能显著加快Nrf2的降解,使Nrf2降解的半衰期由4h下降到1h左右,加入MG132预处理后,UFBP1不再调控Nrf2蛋白水平;通过泛素化实验,我们进一步发现UFBP1能促进Nrf2的泛素化修饰,且主要形成K48位多聚泛素链;在SGC7901细胞中敲低Nrf2后,UFBP1不再影响顺铂诱导的细胞凋亡;另外tBHQ预处理过表达UFBP1的胃癌细胞MGC803后,UFBP1也不再影响顺铂诱导的细胞凋亡;小鼠荷瘤实验证实UFBP1高表达能显著增加顺铂对肿瘤生长的抑制作用,但是加入tBHQ后,UFBP1不再影响顺铂对肿瘤生长的抑制作用;通过对术后使用铂类为基础化疗药物的进展期胃癌病人组织进行免疫组化分析,发现UFBP1高表达显著延长胃癌病人无瘤生存期（P=0.0447）;公共数据库的资料分析进一步提示同一群患者中UFBP1mRNA高表达或AKR1C2 mRNA低表达均能显著延长胃癌患者的总生存期,胃癌患者中UFBP1与AKR1C2的mRNA表达存在一定的负相关。研究结论:UFBP1不影响胃癌细胞的增殖和细胞周期的进展,但却能显著增加胃癌细胞对顺铂和奥沙利铂的药物敏感性,增加顺铂诱导的细胞凋亡。UFBP1的这一新功能是通过与氧化应激反应关键核转录因子Nrf2发生相互作用,增加其泛素化修饰,促进其通过泛素蛋白酶体途径降解,进而下调其下游靶基因AKR1 Cs的转录和蛋白表达而实现的。本研究从分子、细胞、动物和临床样本水平系统地阐明了犹素修饰系统关键蛋白UFBP1与胃癌细胞化疗药物敏感性的关系,并揭示了其具体的分子机制,提示UFBP1是胃癌患者使用铂类化疗药物预后的分子标志物,为临床合理用药提供了理论依据。