一、研究背景和目的转移是恶性肿瘤的特点之一,也是造成肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤转移过程极其复杂,包括肿瘤细胞从原位肿瘤脱落,脱落的肿瘤细胞与基质黏附、释放基质水解酶破坏和穿过基底膜,侵袭血管和淋巴管,进入循环并最终达到转移部位,在新的部位定居并增殖。细胞的迁移运动能力和侵袭能力是决定肿瘤转移能力的重要因素。肿瘤的迁移涉及细胞骨架和形态的改变、细胞的粘附和运动,期间参与调控的有多种生长因子、细胞粘附分子、与细胞运动有关的小G蛋白(如小G蛋白Rho亚家族的成员RhoA,RhoB和RhoC),骨架调节蛋白和趋化因子等。而肿瘤细胞的侵袭能力除了与其增殖和运动迁移能力有关外,还与其降解细胞外基质的能力,如分泌基质金属蛋白酶(MMPs)以及一些蛋白酶的激活物,如尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)等有关。近年来的研究已证明肿瘤细胞的转移潜力还依赖于肿瘤的微环境。由于肿瘤转移过程极其复杂,参与调控的因素很多,其机制目前仍不很清楚。最新的临床资料研究,流行病学研究和动物模型为基础的研究均提示慢性应激影响肿瘤的进展,因此由于应激导致的神经内分泌改变对肿瘤发生发展的影响近年来很受关注。已有一些研究表明交感和肾上腺素系统直接有促进肿瘤进展和转移的作用。糖皮质激素(glucocorticoid,GC)是体内另一个重要应激激素,在躯体和心理应激时血浆中GC明显增高。此外,人工合成的GC,如地塞米松(Dex)被临床广泛用于治疗免疫与炎症性疾病(如红斑狼疮和类风湿性关节炎),以及作为重要的辅助药物用于减轻因肿瘤化疗治疗带来的不良反应(如过敏,恶心呕吐等),这些也可导致体内GC水平的增高。GC的作用通过糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)介导。作为激素依赖性的转录因子,激活的GR以二聚体的形式与靶基因启动子中的糖皮质激素反应元件(glucocorticoid response element,GRE)结合,直接地调节(促进或者抑制)基因表达,或者通过与其他转录因子(如NF-κB和AP-1等)相互作用而间接地调节基因表达,产生生物学效应。近年来的国外和我们的研究都表明GC还可影响细胞内多种信号分子的表达和活性,并在细胞内的信号网络调控中发挥重要作用。目前认为GC对实体肿瘤的作用主要通过其对免疫系统的作用,即通过其强大的免疫抑制作用,促进肿瘤细胞的免疫逃逸,从而促进肿瘤的发生和发展。迄今GC对肿瘤细胞迁移、侵袭和转移的研究十分有限,而且已报道的结果因肿瘤细胞的类型以及所用的肿瘤模型不同而各异,既有促进作用,也有抑制作用,至今不明确,其作用机制也不清楚,因此这方面有进一步研究的必要。卵巢癌是妇科致死率最高的肿瘤。大于70%的卵巢癌在发现时就已是晚期,伴有盆腹腔或远处转移。但目前对于卵巢癌转移的机制还不清楚,因此研究卵巢癌的转移十分必要。已有的研究表明卵巢癌组织中gr的阳性率高达88%,比er和pr都高,表明gc/gr信号通路在卵巢癌的发生和发展中起着十分重要的作用。国外和我们实验室的研究发现gc能轻度抑制卵巢癌细胞的增殖,增强卵巢癌细胞与细胞外基质的粘附,改变多种与细胞存活和凋亡相关的信号通路促进化疗药作用下卵巢癌细胞的存活。有研究表明远处转移的卵巢癌组织中gr的靶基因糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白(gilz)高表达,且高表达的gilz能激活pi3k/akt的通路,促进卵巢癌的增殖和侵袭,这强烈提示gc与卵巢癌的侵袭转移密切相关。既往的研究也证实作为应激激素之一的gc对卵巢癌细胞侵袭有促进也有抑制作用。是否与卵巢癌细胞的来源和侵袭性的不同而有差异还不很清楚,有进一步研究的必要。因此本课题研究了gc在体外和体内对卵巢癌细胞迁移、侵袭和转移的影响,并在此基础上进一步探讨了gc促进卵巢癌细胞迁移侵袭的机制。二、研究方法我们在卵巢癌ho-8910、skov3和a2780细胞中进行体外实验,100nmdex(人工合成的gc)处理细胞,用含10%去激素血清的培养基以去除血清中的激素对细胞的影响。罗丹明-鬼笔环肽染色肌动蛋白(actin),共聚焦显微镜拍照。transwell小室和细胞划痕实验分别检测细胞的垂直和水平迁移能力。预包被matrigel胶的transwell小室(侵袭小室)检测细胞的侵袭能力。细胞粘附实验检测细胞与细胞外基质的粘附能力。rho-gtppulldown实验检测rhob和rhoc的活性。westernblot检测蛋白的表达和蛋白的磷酸化水平。sirna干扰实验抑制目的基因的表达。流式细胞仪检测细胞表面整合素的分布。elisa方法检测纤连蛋白(fn)的分泌。体内实验我们采用babl/c裸鼠腹腔注射卵巢癌细胞制备转移瘤模型。饮水中给予皮质酮(小鼠体内的gc)升高裸鼠血浆皮质酮水平。放射免疫方法检测裸鼠血浆皮质酮水平。he染色确定转移灶的病理性质。嘌呤霉素筛选法筛选稳定干扰rhob的卵巢癌细胞。三、研究结果(一)gc在体外和体内均能促进卵巢癌细胞迁移、侵袭和转移。1、人工合成的gc-地塞米松(dex)在体外能促进卵巢癌细胞形态发生纤维样改变,诱导细胞骨架重组(应力纤维增多),增强细胞与细胞外基质的粘附能力,促进细胞迁移和侵袭。2、在babl/c裸鼠腹腔注射卵巢癌细胞制备的转移瘤模型中,给予皮质酮(小鼠体内的gc)饮水(50mg/l)能明显升高裸鼠血浆皮质酮水平,并在体内促进卵巢癌细胞腹腔和肝脏转移。(二)gc能影响多种转移相关信号通路分子的表达和/或活性,促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭和转移。1、糖皮质激素受体(gr)拮抗剂ru486能完全阻断dex对卵巢癌细胞的迁移促进作用,表明dex对卵巢癌细胞的促迁移作用通过gr介导。2、dex能促进卵巢癌细胞表达和分泌重要的细胞外基质成分-纤连蛋白(fn),并能增加细胞粘附分子整合素β1和α5(fn的受体)在卵巢癌细胞表面的分布,用fnsirna干扰fn的表达能明显抑制dex对卵巢癌细胞的粘附、迁移和侵袭的促进作用。3、dex能激活pi3k/akt信号通路,其激活最早的时间点在12小时,表明激活pi3k/akt信号通路不是dex的直接作用,fnsirna干扰fn的表达能明显抑制pi3k/akt信号通路的激活,提示整合素α5β1和fn结合导致的细胞粘附增强可能与pi3k/akt信号通路的激活有关。用pi3k/akt通路的抑制剂wortmanin能完全阻断dex诱导卵巢癌细胞骨架重组和dex对卵巢癌细胞的迁移和侵袭的促进作用,表明pi3k/akt通路的激活在dex促进卵巢癌细胞迁移和侵袭的作用中十分重要。4、小g蛋白rho亚家族(rhoa,rhob和rhoc)是重要的细胞迁移和运动的调控蛋白,与gtp结合是它们的活性形式。我们发现dex能激活rhob和rhoc,dex还能增加rho下游的rock2蛋白的磷酸化水平,激活rock2。rock2的特异抑制剂fasudil抑制rock2的活性后能明显抑制dex对卵巢癌细胞的迁移和侵袭的促进作用。5、鉴于rhoa和rhoc促进细胞迁移的作用已经十分明确,而rhob在细胞迁移和肿瘤转移中的作用还不清楚,因此我们重点研究了dex激活rhob在其促进卵巢癌细胞黏附、迁移、侵袭和肿瘤转移中可能的作用。体外实验发现用rhobsirna干扰rhob表达能抑制dex促进fn分泌以及激活pi3k/akt信号通路的作用。更为重要的是,干扰rhob的表达在体外能显著抑制dex对卵巢癌细胞的粘附、迁移和侵袭的促进作用,在体内也能明显抑制皮质酮促进卵巢癌细胞肝转移的作用。6、dex还能上调卵巢癌细胞中基质金属蛋白酶mmp3和mmp7的表达。用BB-94抑制MMPs的活性能明显阻断Dex对卵巢癌细胞的侵袭促进作用。四、结论GC在体外和体内均能促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭和转移,该作用通过GR介导。GC能通过促进FN/integrin介导的粘附激活PI3K/AKT信号通路,并能激活RhoC/ROCK2信号通路,在GC促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭中发挥重要作用。GC还能通过上调和激活小G蛋白RhoB促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭和体内转移,该作用与其促进FN分泌,增加细胞黏附进而激活PI3K/AKT信号通路有关。此外GC上调的MMP3和MMP7表达也与GC促进卵巢癌细胞的侵袭密切相关。以上结果首次揭示了GC能通过影响细胞内多种重要信号分子的表达和活性促进卵巢癌的迁移、侵袭和转移。