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[目的]通过对慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者接受恩替卡韦(Enticavir,ETV)抗病毒治疗前后外周血辅助性T淋巴细胞17(helper T cell 17,Th17)与调节性 T 淋巴细胞(regulatory T cell,Treg)所占 CD4+T 淋巴细胞的百分比及其各自相应的特异性转录因子——维甲酸相关核孤儿受体γt(Retinoid-related orphan nuclear receptor yt,RORyt)和叉头/翅膀状螺旋转录因子 3(Forkhead/winged helix family transcription factor 3,Foxp3)mRNA 相对表达水平的检测,同时动态检测外周血丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransteras,AST)、总胆红素(total Bilirubin,TBIL)、乙型肝炎病毒 e 抗原(hepatitis Be antigen,HBeAg)状态和HBV DNA的水平变化,探讨CHB患者接受ETV抗病毒治疗过程中体内Th17细胞、Treg细胞、RORyt和Foxp3的变化情况以及Th17/Treg平衡在CHB进程中可能发挥的作用。[方法]本研究选取于2015年5月至2016年8月期间来昆明医科大学第一附属医院感染科接受治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者60例为研究对象,其中男性38例,女性22例。同时以同时期来我院体检的健康者22例作为健康对照组,其中男性14例,女性8例。所有患者给予恩替卡韦0.5mg/d抗病毒治疗48周。分别于ETV治疗前、治疗第12周时、治疗第24周时、治疗满48周时测定外周血ALT、AST、TBIL、HBeAg和HBVDNA,于ETV治疗前和治疗满48周时测定外周血Th17细胞和Treg细胞的百分比以及其相应的特异性转录因子RORyt和Foxp3的mRNA表达水平。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)分析仪测定患者血清HBV DNA载量;采用全自动生化分析仪检测ALT、AST、TBIL等肝功能指标;采用流式细胞仪分析外周血Th17细胞和Treg细胞的百分比;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR,reverse-transcription qPCR)法测定外周血特异性转录因子 RORyt和Foxp3的mRNA表达水平;采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法测定 HBeAg 水平。应用 SPSS 19.0 统计学软件对所有数据进行统计分析。[结果]1.60例HBeAg阳性CHB患者中男性占63.3%(38/60),女性占36.7%(22/60),平均年龄为35.8±7.3岁,HBV DNA平均水平为1.83 × 108 cp/ml,所有患者HBV DNA基线水平均大于1.0×105cp/ml,其中HBV DNA基线水平大于 1.0×107 cp/ml 患者占 81.7%(49/60)。治疗前,CHB 患者 ALT(211.60±103.11 vs 27.64±6.16)、AST(143.57±65.94 vs 22.41±4.40)及 TBIL(15.69±5.63 vs 12.24±2.36)水平均高于对照组,CHB患者Th17细胞(3.18±5.80 vs 3.19±1.36)、Treg 细胞(3.25± 1.44 vs 1.60±0.91)、RORγt(2.77±2.31 vs 1.41±1.08)和Foxp3(2.75±1.14vs1.98±0.80)表达水平也均高于对照组,且差异均具有统计学意义(均P<0.05);治疗48周时,CHB患者ALT(34.25±6.71 vs 27.64±6.16)、AST(27.50±4.00 vs 22.41 ±4.40)和 RORγt(1.70±0.88 vs 1.41±1.08)水平均高于对照组,且差异具有统计学意义(均P<0.05),而TB(12.82±3.71 vs 12.24±2.36)、Th17 细胞(2.96±1.67vs3.19±1.36)、Treg 细胞(1.88±1.12 vs 1.60±0.91)和Foxp3(1.62±0.99 vs 1.98±0.80)的水平与对照组基本维持在同一水平且差异均不具有统计学意义(均P>0.05)。2.与ETV抗病毒治疗前比较,CHB患者治疗第12周、24周、48周时,ALT(39.00±21.50;36.00±7.00;34.25±6.71 vs211.60±103.11)、AST(32.00± 18.25;29.50±6.75;27.50±4.00 vs 143.57±65.94)、TB(15.41±4.20;13.29±3.74;12.82±3.71vs15.69±5.63)和lgHBV DNA(4.31±2.15;3.09±1.44;3.00±0.00vs7.66±0.91)水平,除治疗前与治疗12周时TB下降不明显外,其余指标均显著下降,且差异均具有统计学意义(均P<0.05)。CHB患者治疗第12 周、24 周、48 周时,ALT 复常率分别为 53.3%(32/60)、78.3%(47/60)和93.3%(56/60);HBV DNA 转阴率分别为 31.7%(19/60)、48.3%(29/60)和80.0%(48/60);HBeAg 转阴率分别为 15.0%(9/60)、20.0%(12/60)和 31.7%(19/60)。3.与ETV抗病毒治疗前比较,CHB患者ETV治疗满48周时,无论是Th17细胞(2.96±1.67vs3.18±5.80)与 Treg 细胞(1.88±1.12vs3.25±1.44)在外周血中占CD4+T细胞的百分比,还是其各自的特异性转录因子RORyt(1.90±1.01 vs2.77±2.3)与 Foxp3(1.70±0.88 vs2.75±1.14)的相对表达水平,除 RORyt外,其余3项指标较治疗前均显著下降,且差异均具有统计学意义(均P<0.05)。与治疗48周时HBV DNA未转阴患者(12/60)比较,HBV DNA转阴患者(48/60)的 Th17 细胞(2.29±1.08vs5.63±3.67)、Treg 细胞(1.52±0.90vs3.35±0.59)、RORyt(1.63±0.9vs3.01±0.54)和 Foxp3(1.49±0.82vs2.56±0.52)表达水平明显降低,且差异均具有统计学意义(均P<0.05)。与治疗48周时HBeAg血清学未转换患者(41/60)比较,HBeAg血清学转换患者(19/60)的Th17细胞(1.97± 1.26 vs 3.42 ± 1.84)、Treg 细胞(0.95 ± 0.77 vs 2.32 ± 0.98)、RORyt(1.15±0.93vs2.25±0.86)和 Foxp3(1.04±0.77vs2.01±0.75)表达水平明显降低,且差异均具有统计学意义(均P<0.05)。4.Th17细胞与Treg细胞的比值(Th17/Treg)在ETV开始抗病毒治疗前与治疗满48周时相比较差异不具有统计学意义(1.56±0.55vs 1.62±0.99,P>0.05);抗病毒治疗开始时的Th17/Treg(1.56±0.55)与治疗满48周时的Th17/Treg(1.62±0.99)相较而言,随着ETV抗病毒治疗时间的延长,Th17/Treg之间的平衡基本维持稳定。Th17细胞与Treg细胞的比值(Th17/Treg),CHB患者在ETV抗病毒治疗前与健康对照组相较(1.56±0.55 vs 2.92±2.41),CHB患者Th17/Treg水平显著性低下(P<0.05);当ETV治疗满48周时,CHB患者Th17/Treg水平较健康对照组(1.62±0.99vs2.92±2.41)无显著性差异(P>0.05);在ETV开始抗病毒治疗前与治疗满48周时相比较差异不具有统计学意义(1.56±0.55 vs 1.62±0.99,P>0.05)。5.经广义线性混合模型(generalized linear mixed model,GLMM)及秩相关分析发现,在ETV抗病毒治疗的过程中,HBV的病毒载量对于Th17细胞、Treg细胞以及RORyt与Foxp3的mRNA相对表达水平的影响较其余3个评价指标(ALT、AST和TB)所产生的影响大且呈正相关(相关系数分别是0.627,0.704,0.721和0.657,均P<0.05)。其中,对于Th17细胞而言,HBVDNA对于Treg细胞百分比的影响作用更大一些。6.无论是ETV开始抗病毒治疗前还是ETV抗病毒治疗满48周时,Th17细胞与RORyt的mRNA表达水平或是Treg细胞与Foxp3的mRNA表达水平均呈显著性正相关(相关系数分别是0.845和0.890,均P<0.05)。[结论]在ETV抗病毒治疗前,即HBV DNA复制活跃的时期(HBeAg阳性),Th17细胞参与促进炎症反应,而Treg参与抑制炎症反应,因而在未接受抗病毒治疗的CHB患者体内,机体会通过自身免疫调节作用使得CD4+T淋巴细胞向Treg细胞分化以产生炎症抑制反应,从而保护肝脏炎症反应过度。随着CHB患者接受ETV抗病毒治疗时间的延长,HBV DNA转阴率和HBeAg转阴率均相应升高,CD4+T淋巴细胞向Th17细胞和Treg细胞的分化减少,ETV通过抑制HBV的病毒复制从而间接参与调节机体的免疫炎症反应过程,以进一步加快肝脏炎症反应的控制,以上过程的调节可由HBV DNA作为间接反映指标。此外,Th17/Treg之间的平衡在HBV复制活跃阶段,向Treg细胞偏斜,从而避免肝脏炎症反应过度,随ETV抗病毒治疗的进展,Th17/Treg之间恢复平衡,这种变化对于肝脏炎症反应的控制具有重大意义——避免肝脏炎症向肝纤维化甚至是肝衰竭(liver failure,LF)方向进展,这对CHB患者愈后的预测具有指导性意义。